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가. 정성 시험 방법

가-1. Micropipette를 사용하는 경우

1) 본 시험은 96well에 가로줄 1-12, 세로줄 A-H로 표시된 U형 바닥 Microplate를 사용한다.

2) 첨부된 dropper로 용해액을 1-A well에 2방울(50ul), 2-A well, 3-A well, 4-A well에 1방울(25ul)씩 떨어뜨린다.

3) Micropipette로 검사하고자 하는 혈청 5ul를 1-A well에 넣는다.

4) 1-A well로부터 4-A well까지 2ⁿ 희석을 한다.

5) Dropper로 1-A well에 대조 적혈구액 1방울(25ul)을 2-A, 3-A, 4-A well에 단일 클론 anti-AFP 흡착 면양 적혈구액 1방울(25ul)씩을 떨어뜨린다.

6) 이 Microplate를 Micromixer로 약 10초간 진탕한 후 실온에서 1시간 30분 정치시킨다.(단, 정치시 plate 상면을 덮어 두며 충격을 가하지 않는다.)

7) 대조용 양성혈청에 대한 응집반응 시험도 검체와 같은 요령으로 실시한다.

1-A well의 실제 희석배수는 1:11이지만 단수를 생략하고 1:10으로 간주한다.

가-2. Micropipette를 사용하지 않는 경우

1) 용해액을 1-A well에 4방울(100ul), 2-A, 3-A, 4-A, 5-A well에 1방울(25ul)씩 넣고 검체를 Diluter로 25ul 취해 1-A well에 넣고 2ⁿ 희석한다.

2) 2-A well에 대조 적혈구를, 3-A, 4-A, 5-A well에 단일 클론 anti-AFP 흡착 면양 적 혈구액을 각각 1방울(25ul)씩 떨어뜨린다. 이하 방법은 Micropipette를 사용하는 경 우와 동일하게 실시한다.

나. 정량 시험 방법

정성시험 방법에서 양성으로 나온 검체에 대해서는 확인의 의미로 정량 시험을 실시한다.

1) Microplate에 용해액을 Dropper로 1-A well에 2방울(50ul), 2-A well부터 최종 well(8-A well이상)까지 1방울(25ul)씩 떨어뜨린다.

2) 이어서 Micropipette로 검체를 5ul 취해 1-A well에 넣고, 최종 well까지 2ⁿ 희석한다.

3) 1-A well에 대조적혈구액을, 2-A well부터 최종 well까지는 단일 클론 Anti-AFP 감작 면양 적혈구액을 1방울(25ul)씩 떨어뜨린다.

4) 이하의 조작은 정성 시험법과 동일하게 실시한다.

가. 정성시험 판정 방법

1) 대조적혈구 및 단일 클론 Anti-AFP 흡착 면양 적혈구액에서 응집이 일어나지 않으면 음성(12.5ng/㎖ 이하)으로 판정한다.

2) 대조적혈구는 응집이 일어나지 않고 단일 클론 Anti-AFP 흡착 면양 적혈구액에서 응집가가 혈청희석배율 20배 이상이면 양성(12.5ng/㎖ 이상)으로 판정한다.

3) 대조적혈구 및 단일 클론 Anti-AFP 흡착 면양 적혈구액에서 응집이 동시에 일어나면 흡수 적혈구를 이용하여 흡수시킨 후 재검사한다.

4) AFP 함량이 40㎍/㎖ 이상인 경우 혈청 희석 배율 20배 이상에서 prozone 현상이 나타날 수 있으며 이런 경우는 응집상이 역으로 생길 수 있다.

예) 혈청 희석 배율 20× 40× 80×

●(-) O(+) ○(++)

●(-) ●(-) O(-)

이런 경우는 검체를 용해액으로 100배 희석한 후 재검사 확인한다.

나. 정량 시험 판정 방법

대조적혈구에서 응집이 일어나지 않고 단일 클론 Anti-AFP 흡착 면양 적혈구액에서 응집상이 보이는 경우는 응집상이 인정되는 최종혈청 희석배수에 0.625를 곱하여 AFP함량으로 한다.

즉, 응집된 최종 혈청 희석 배수 ×0.625 = AFP함량(ng/㎖)

● 응집가 판독 및 판정법

※ 응집가라 함은 응집이 인정된 (+) 최종 혈청 희석 배율을 말한다.

대조적혈구 및 단일클론 anti-AFP 흡착면양적혈구에서 동시에 응집이 일어나는 (양성)검체는 아래 순서에 의해 흡수 조작을 한 후 재시험을 한다.

1) 건조 흡수용적혈구를 용해액 1㎖로 용해한다.

2) 0.5㎖를 취해 원심(3,000rpm, 10분)하여 상층을 완전히 제거한다.

3) 이 혈구 침강물에 용해액 250ul를 넣고 잘 흔들어 부유시킨 후 검체 25ul를 가해 혼합하여 실온에서 30분 이상 방치한다.(중간에 1-2회 잘 흔들어 준다.)

4) 원심(3,000rpm, 10분)하여 상청 50ul를 주의깊게 분리하여 Microplate 1-A well에 넣고, 2-A well 이상에는 미리 용해액을 25ul씩 취해, 1-A well부터 2ⁿ 희석한다.

5) 대조적혈구액을 1-A well, 단일클론 anti-AFP 흡착면양적혈구액을 2-A well 이상에 25ul씩 떨어뜨린다.

6) 이하 조작은 정성 시험법에 준한다.