제네디아헬리코박터파이로리아이지에이엘리자 - 의약품 상세정보

1) 혈장 또는 혈청을 검체로 사용하며 혈구나 혈액응고성분 등의 고형물을 원심하여 완전히 제거한다.

1) 모든시약은 실험시작 15-30분전에 실온에 둔다.

2) 밀봉된 항원 흡착 플레이트를 꺼내어 필요한 만큼의 strip을 꺼내고 보관하고자 하는 strip은 frame에서 빼내어 첨부된 은박포에 실리카겔과 함께 넣어 2-8℃에 보관한다. 이때 보관중인 은박포내에 습기가 들어가면 항원 역가의 저하를 일으킬 수 있으니 주의한다.

3) 검체희석액의 조제

검체희석액(2배 농축액/4번병)을 증류수나 이온정제수로 1:1의 비율로 필요한 양만큼 희석한다. [실험시 1 strip(8검체)당 검체희석액(2배농축액) 5㎖에 증류수나 이온정제수 5㎖를 혼합하여 조제한다.]

검체희석액(4번병)은 침전이 있을 수 있으니 충분히 혼합하여 사용한다.

4) 세척액의 조제

농축세척액(5번병)을 증류수나 이온정제수로 20배 희석하여 필요한 양만큼 준비한다. [필요한 세척액량이 200㎖일 경우 농축세척액 10㎖에 증류수나 이온정제수 190㎖을 넣어 총부피가 200㎖가 되도록 한다음 잘 섞는다.]

농축세척액은 냉장보관상태에서 결정이 생길 수도 있다. 이 경우에는 37℃ 항온수조에서 녹인다음 사용한다.

5) 접합체액의 조제

사용하기 10분전에 농축접합체액(6번병)을 접합체희석액(7번병)으로 1:100의 비율로 필요한 양만큼 희석한다. [실험시 1 strip(8well)당 기질액 20㎕에 기질용완충액 2㎖을 혼합하여 조제한다.] 접합체희석액(7번병)은 침전이 있을 수 있으니 충분히 혼합하여 사용한다.

6) 기질액의 조제

기질액은 사용하기 5-10분전에 기질액(8번병)과 기질용완충액(9번병)으로 1:100의 비율로 혼합하여 사용한다. [실험시 1 strip(8well)당 기질액 20㎕에 기질용완충액 2㎖을 혼합하여 조제한다.] 혼합된 기질은 직사광선을 피하여 보관한다.

기질액(8번병)은 냉장에서 얼어 있으니 반드시 37℃ 수조에서 녹여 균질화한 후 사용하여야 한다. (기질액의 어는점 18℃)

1) 시험에 필요한 양만큼의 Strip을 꺼내어 Frame에 고정시킨다.

2) 깨끗한 eppendorf tubes를 준비하여 양성 대조액, 음성 대조액 및 검사하고자 하는 검체를 각각 5㎕씩 넣고 여기에 검체 희석액을 각각 500㎕씩을 가한 후 잘 흔들어 혼합한다.

3) 플레이트의 1A, 1B, 1C well에 희석된 음성대조액(2번병)을, 1D, 1E well에 희석된 양성 대조액(3번병)을 각각 200㎕씩 차례대로 넣고 나머지 각 well에 희석된 검체를 200㎕씩 차례대로 넣는다.

4) 플레이트를 첨부된 sealer로 밀봉한 다음 37±1℃에서 60분간 반응시킨다.

5) 4)번 반응이 끝나기 5-10분전에 농축접합체액(6번병)을 접합체희석액(7번병)으로 1:100의 비율로 필요한 만큼 희석한다.

6) 각 well의 내용물을 흡입해내고 조제한 세척액으로 5회 세척한다. (각 well당 300㎕)

7) 세척된 플레이트를 흡습지에 뒤집어 가볍게 쳐서 세척액을 완전히 제거한 다음 5)에서 조제된 접합체액을 각 well에 200㎕씩 넣고 Frame을 가볍게 쳐서 잘 혼합한다.

8) 플레이트를 sealer로 잘 밀봉한 후 37±1℃에서 30분간 반응시킨다.

9) 8)번 반응이 끝나기 5-10분전에 기질액(8번병)을 기질용완충액(9번병)으로 1:100의 비율로 필요한 양만큼 희석하여 기질액을 조제한다.

10) 각 well의 내용물을 흡입해내고 조제한 세척액으로 5회 세척한다. (각well당 300㎕)

11) 세척된 플레이트를 흡습지에 뒤집어 가볍게 쳐서 세척액을 완전히 제거한 다음 8)번에서 조제한 기질액을 각 well에 200㎕씩 넣고 frame을 가볍게 쳐서 잘 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨다. 이 반응은 직사광선을 피하여 실시한다.

12) 반응정지액(10번병)을 100㎕씩 각 well에 넣고 플레이트를 가볍게 쳐서 발색물을 균질화한다.

13) 공기를 맹검으로 하고(Air blank) 음성대조액, 양성대조액 및 검체의 흡광도를 측정한다. 흡광도의 측정은 측정파장 450nm, 참조파장(Reference wavelength)은 620nm로 한다. 흡광도는 반응정지액(10번병)을 넣은 후 30분 이내에 측정한다.

양성대조액의 흡광도 값이 모두 0.8 이상이고 세 개의 음성대조액 중 2개 이상의 흡광도값이 0.200 이하이면서 그 평균값이 0.000 이상 0.200 이하이어야 한다. 만약 이 기준에 적합하지 않을 경우에는 실험 기술상의 문제나 시약의 변질로 인한 것으로 생각되므로 그 원인을 확인하여 재 실험을 실시한다.

1) 판정기준치(Cutoff Value) 산출

가. 음성대조액의 평균값을 구한다.

예) 음성대조액의 1의 흡광도값 0.010

음성대조액의 2의 흡광도값 0.005

음성대조액의 3의 흡광도값 0.015

음성대조액의 평균 흡광도값(NCX) = (0.010+0.005+0.015)/3 = 0.010

나. 판정기준치의 산출

판정기준치(Cutoff Value) = NCX + 0.3

= 0.010 + 0.3

= 0.310

2) 판정

판정기준치 이상의 흡광도값을 갖는 검체를 양성으로 판정하며 이 값 미만의 흡광도값을 갖는 검체는 음성으로 판정한다.

** 만일 검체가 판정기준치 ±10%의 흡광도값을 갖는다면 2주후에 다시 혈청을 채취해서 2회 실험을 실시하여 두 번 모두 음성결과를 나타내면 음성으로 판정하고 한 번이상 양성결과를 나타내면 다른 혈청학적 확인검사(western blot 등)를 통하여 최종판정한다.