에스디말라리아항원엘리자 - 의약품 상세정보

1) 검체 준비

(1) 전혈만 검체로 사용할 수 있으나 심하게 용혈된 검체는 쓸 수 없다. 혈액 응고 성분 등의 고형물이 있는 검체는 비특이 반응을 유발하므로 가능한 사용하지 않는다.

(2) 검체 체취시 넣어주는 전형적인 항응고제(EDTA,citrate,Heparin)는 본 검사법을 방해하지 않는다.

(3) 전혈 검체는 2~8℃에서 보관할 경우 3일 까지 본 시약을 이용한 검사에 사용 가능하며, 장기간 보관된 전혈은 비특이 반응을 일으킬 수 있다.

(4) 용혈이 심하거나 미생물에 오염된 검체의 경우는 부정확한 결과를 나타낼 수 있으므로 주의한다.

2) 검사과정

[주의사항]

(1) 시약을 약 30분 전에 15~30 ℃에 서 예열시킨다.

(2) 시험 후 남은 항체흡착플레이트는 자체 은박포에 실리카겔 포와 함께 잘 밀봉하여 2~8℃에서 냉장 보관한다.

(3) 전혈 검체는 사용 전에 충분히 혼합하여 균질화시킨 후 사용한다.

(4) 검사하는 전혈 검체와 효소표지항체용액을 검액조제용 마이크로플레이트 (코팅되지 않은 플레이트) 웰 (well) 내에서 용혈반응을 시킬 때, 균질하게 혼합을 하여야 정확한 결과를 가져올 수 있으므로 혼합기 또는 피펫을 사용하여 잘 섞어준 후 15~30분 동안 15~30℃에서 정치시켜 침전물을 가라앉힌다.

(5) 용혈 반응이후 검체와 효소표지항체용액 혼합물 상층액을 침전이 딸려오지 않게 취하여 말라리아 항체 코팅플레이트 각 웰에 넣어야 하며,만약 혼합물에 침전물이 혼입될 경우 비복이 반응을 유발시켜 검사 결과에 많은 영향을 미칠 수 있다.

(6) 6회 세척 완료 후 웰 내에 남아있을 수 있는 잔여 용액을 완전히 제거한 후 기질반응을 진행한다.

[시액의 조제]

1) 효소표지항체액의 준비

농축 효소표지항체액 (101배)을 사용하고자 하는 well수에 따라 용혈 용액으로 101배 희석한다. 즉, 농축효소표지항체액 1: 용혈 용액 100의 비율로서 한, 플레이트를 시험할 경우 농축효소지항체액0.2ml을 용액 20ml로 희석하면된다.

2) 세척액의 준비

농축 세척액()10배)을 정제수 (탈이온수나 증류수)로 10배 희석한다. 세척액은 한 well,당약 3ml가 소요된다. (예 , 증류수 450ml에 농축세척액 50mㅣ을 첨가하여 세척액을 조제한다.)

3) 기질용액의 준비

기질용액 을 사용하고자 하는 well수에 따라 기질용 완충액으로 100배 희석한다. 즉,기질액 1: 기질용완충액100의 비율로서, 한 플레이트를 시험 할 경우 기질액 0.1ml을 기질용완충액 10ml로 희석하면 된다.

[검사 방법]

1) 검사를 시작하기 약 30분전에 시약 구성물들을 상온에ㅣ 방치시켜, 사용 전 가볍게 흔들어 잘 섞어준 후 사용하고 ,프레이트는 상온이 된 후에 개봉하여 사용한다.

2) 검사에 필요한 well수를 결정하고 사용하고 남은 well은 자체은박포에 시릴카겔과 함께밀봉하여 2~8℃에 보관한다

3) 필요한 양만큼의 검액 조제용 플레이트 well을 꺼내 놓는다.

4)101배 농축 효소표지항체용액 을 10배 희석하여 필요한 만큼의 ㎕ 을 조제한다. “시액의 조제”항 참조

5) 조제된 효소표지항체용액 을 검액조제용 플레이트의 각 well에 200㎕씩 분주하고 음성대조액, 양성대조액, 검사하고자하는 시료 각각50㎕씩을효소표지항체용액이 들어있는 각 well에 분주하고 혼합기를 사용하거나 피펫을 사용하여 잘 섞어준다.

6) 시료와효소표지항체용액 혼합물을 15~30℃에서 15~30분간 반응시켜 침전물을 가라앉힌다.

7) 말라리아 항체가 코팅된 프레이트 중 필요한 양 만큼의 스트립을 꺼내어 프레임에 고정한 후, 시료와 효소표지항체액 혼합물 상층을 침전을 딸려오지 않게 100㎕ 씩 취해서 각 well에 넣고 약 10초 이상 시료들이 well 바깥으로 튀지 않게 조심스럽게 흔들어 준 후 플레이트를 첨부된 밀봉테이프로 밀봉한다.

· 혼합물의 침전이 비특이 반응을 유발시켜 검사 결과에 많은 영향을 미친다.

8) 밀봉한 플레이트를 37±1℃에서 90분 동안 반응시킨다.

9)세척액과 기질용액을 “시액의 조제”항에 따라 조제한다.

10) 반응후 각 well의 내용물을 흡입하고 세척액으로 다음과 같은 방법으로 6회 세척한다. 우선,well내의 내용물을 흡입장치로 제거한 후 , 세척액을 well에 완전히 채우고 (well당 약 350㎕씩) 약 5~10초 방치한 후 용액을 흡입하는 방법으로 6회 반복한 다음, 휴지에 대고 살짝 털어 잔여 용액을 제거한다.

11) 미리 조제한 기질용액을 모든 well에 100㎕ 씩 분주하고 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하고, 15~30℃에서 30분 동안 반응시킨다.

12) 반응정지액을 모든 well에 각 well당 100㎕씩 넣고 잘 혼합하여 청색이 노란색으로 완전히 변하도록 한다.

13) 공기를 맹검으로 하여(Air blank)음성대조액,양성대조액 그리고 각 검체의 흡광도를 측정한다. 이때 흡광도의 측정 파장은 450㎜로 하고, 이중과장흡광도측정기를 (dual wavelength reader)를 사용할 경우 참조파장은 620㎜로 하며 반응정지액을 넣고 30분 이내에 흡광도 값을 측정한다.

[결과판정]

(1) 정도관리

가. 음성 대조액의 흡광도 값은 -0.005이상 0.015이하이어야 하며 만약 1개의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 나머지 2개 값의 평균값으로 산출한다. 만약 2개 이상의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 재실험을 하여야 한다.

나 . 성 대조액의 평균 흡광도 값은 1.000이상이어야 한다. 양성 표준액의 평균 흡광도 값이 위범위를 벗어났을 경우에는 검사과정이나 시약에 문제가 있는 것이므로 그 원인을 확인한 후 재검사 하여야 한다.

(2) 판정 기준값(Cut-off)계산 및 판정

가. 음성대조액 평균값 계산

상기 검사방법에 따라 음성대조액의 흡광도를 얻은 다음 그 세 값의 평균값을 산출한다.

예)

나. 양성대조액, 평균값 계산

상기 검사방법에 따라 양성대조액의 흡광도를 얻은 다음 그 두 값의 평균값을 산출한다.

예)

다. 판정 기준값(Cut-off) 계

음성대조액 평균흡광도(NCx)값에 0.050을 더하여 판정기준값을 구한다.

예) NCx+0.050=0.050+0.050=0.100

라. 결과의 판정

가) 음성 : 판정 기준값 미만의 흡광도값을 나타내는 검체는 음성으로 판정 한다.

나) 양성 : 판정 기준값 이상의 흡광도값을 나타내는 검체는양성으로 판정 한다.

● 1차 검사에서 양성 판정 검체는 2 wells 이상 재검사하고 재검결과에서 1well 이상 양성으로 판정되면 최초양성으로 판정한다.

● 최초 양성 판정 검체는 임상적인 소견과 혈액 도말의 현미경 관찰 시 원충확인으로 감염여부를 판정한다.