안국바이오진단HPV진단용DNA칩키트 - 의약품 상세정보

(1) 임상 검체로부터 디엔에이(DNA) 추출

① 환자로부터 채취된 자궁경부 세포진 검체가 세포진 채취통(cervical swab sampler)의 세포보존용액(약 2.0mL)에 잘 섞여 있는지를 육안으로 확인함

② 5mg의 프로테이나제 케이를 1.25mL의 정제수에 용해시켜 프로테이나제 용액을 만듦.

③ 용해튜브에 20㎕의 프로테이나제 용액과 400㎕의 자궁경부 세포진 검체 (cervical swap sample)을 넣음. 사용하고 남은 프로테이나제 용액은 기밀을 유지하여, -20℃에 보관함.

④ 200㎕의 디엔에이추출시약 1을 넣고, 약 5초간 흔든 후, 용해튜브를 60℃에 약 10분간 유지시킴

⑤ 100㎕의 이소프로판올 알코올을 넣고 약 5초간 흔듬

⑥ 용해튜브내의 용액을 디엔에이바인딩컬럼으로 옮김.

⑦ 원심분리기를 이용하여 디엔에이바인딩컬럼을 8000 rpm으로 2분간 원심분리함.

⑧ 여과된 용액을 버리고 500 ㎕의 디엔에이추출시약 2를 넣음

⑨ 원심분리기를 이용하여 디엔에이바인딩컬럼을 8000 rpm으로 2분간 원심분리함.

⑩ 여과된 용액을 버리고 500 ㎕의 디엔에이추출시약 3을 넣음

⑪ 원심분리기를 이용하여 디엔에이바인딩컬럼을 13000 rpm으로 2분간 원심분리함.

⑫ 여과된 용액을 버리고 디엔에이바인딩컬럼을 13000 rpm으로 2분간 원심분리함.

⑬ 디엔에이바인딩컬럼을 새로운 용해튜브로 옮기고, 정제수 100 ㎕를 디엔에이바인딩컬럼에 넣어 5분간 용해, 분리(elution)함.

⑭ 원심분리기를 이용하여 디엔에이바인딩컬럼을 13000 rpm으로 2분간 원심분리함. 디엔에이바인딩컬럼을 버리고 100 ㎕의 디엔에이(DNA)를 4℃에 보관함.

⑮ 0.7% 아가로즈겔에 5㎕을 전기 영동하여 DNA가 있음을 확인함. 전체적으로 인간유전자의 크기가 10Kb ~ 100Kb까지 커다란 유전자로, 전기영동표준물질을 이용할 수 없음. 확인 후, 추출된 유전자를 5㎕씩 증폭용 튜브에 분주하여 넣음

(2) HPV L1 유전자와 beta-globin 유전자의 증폭

① 14.7㎍의 HPV 프라이머 1 을 80㎕ 정제수에 녹여 HPV 프라이머용액 1 을 만듦.

② 12.7㎍의 HPV 프라이머 2 을 68㎕ 정제수에 녹여 HPV 프라이머용액 2 을 만듦.

③ 12.8㎍의 BG 프라이머 1을 115㎕ 정제수에 녹여 BG 프라이머용액 1을 만듦.

④ 14.6㎍의 BG 프라이머 2을 120㎕ 정제수에 녹여 BG 프라이머용액 2을 만듦.

⑤ 표1과 같은 조성으로 HPV 증폭용 혼합액과 BG 증폭용 혼합액을 만듦. 사용 후 남은, Taq 디엔에이중합효소, 프라이머용액, Cy5형광유사체 등은 기밀을 유지하여, -20℃에 보관함.

⑥ 2종류의 증폭용 혼합액을 추출한 유전자를 5㎕ 씩 분주된 증폭용 튜브(상기 (1)-⑮항에서 만듦)에 45㎕씩 더하여, 총 증폭용 혼합액튜브 8개(HPV L1 4개, BG 4개)를 만듦.

⑦ 8개의 혼합액튜브중 HPV L1 및 BG 각 1개식을 혼합액튜브로 증폭에 사용하고, 남는 HPV L1 및 혼합액튜브 6개는 반복실험할 경우에 사용함(실험 오류시 재사용함).

⑧ 각 혼합액튜브는 PCR 장치(T1, Biometra Inc., 미국)를 이용하여 표2의 조건에 따라 DNA를 증폭함.

⑨ 증폭된 유전자를 2%의 아가로젤에서 5㎕를 전기 영동함. 전기영동 전압 200Volt로 약 30분간 수행하여 약 150bp의 HPV L1 및 200bp의 BG 유전자 절편을 확인함. 표준 전기 영동 물질로는 100bp ladder를 이용함.

표1 HPV L1 유전자와 beta-globin 유전자 증폭용 혼합액의 조성액

(4회 반복 실험 가능한 양, 약 200㎕)

표 2. HPV L1 유전자와 beta-globin 유전자의 PCR cycle 조건

(3) 하이브리다이제이션(Hybridization)

① 10㎕의 증폭된 HPV L1 유전자와 5㎕의 증폭된 beta-globin 유전자를 25㎕의 정제수에 섞음. 여기에 4㎕의 수산화나트륨용액을 가한 후, 실온에서 5분간 유지하여 유전자를 변성(denaturation)시킴.

② 2㎕의 트리스완충액과 4㎕의 염산용액을 가한 후, 4℃로 5분간 유지함.

③ 50㎕의 하이브리다이제이션용액과 0.5㎕의 라우릴황산나트륨용액을 가하여 잘 섞음.

④ 섞은 용액을 실리콘웰과 폴리카보네이트박막로 구성된 웰체임버(4 well chamber, 체적은 100㎕임)가 덮어져 있는 디엔에이칩 폴리카보네이트 상의 한쪽 구멍을 통하여 기포가 들어가지 않도록 넣음.

⑤ 40℃의 습식 인큐베이터(Combi-H12, Fine PCR Inc., 미국)에서 2시간 동안 하이브리다이제이션을 실시함.

(4) 세척

① 하이브라다이제션이 끝난, 디엔에이칩에서 실리콘웰과 폴리카보네이트박막을 떼어 냄.

② 세척을 위하여 정방형 실험용 접시(square dish, 125mmX125mmX20mm) 2개에 하이브리다이제이션세척제 1과 2를 각각 125ml씩 부어서 세척제를 준비함.

③ 하이브리다이제이션세척제 1에서 2분간, 하이브리다이제이션세척제 2에서 2분간, 분당 50회의 속도로 흔들어 주면서 세척함. 이때 슬라이드는 각 세척제에 담겨서 슬라이드 전체 표면에 세척제가 닿아야 하며, 상온에서 세척함. 5장의 디엔에이칩을 세척한 후에는 새로운 하이브리다이제이션 세척제 1&2를 사용함.

④ 새로운 하이브리다이제이션세척제 2에서 2분간, 분당 50회의 속도로 흔들어 주면서 세척함.

⑤ 공기 중에서 또는 스핀드라이어를 이용하여, 디엔에이칩 표면에 물기가 없도록 건조함.

(5) 디엔에이칩 스캔 및 영상 분석

① 반응이 끝난 디엔에이칩은 디엔에이칩스캐너(Confocal laser scanner, GenePix 4000B, Axon Instruments, 미국)를 이용하여 laser power 33%, PMT 880, 초점거리 0um에서 발색된 시그날을 확인함.

② 스캔한 디엔에이칩 영상으로부터, 결과 판정을 위한 영상의 화소 값을 분석함.

③ 영상 화소값의 분석은 디엔에이칩의 각 점작 영상의 화소와 화소를 둘러 싼 배경  영상의 화소값 비를 분석하여 결과 판정을 위한 신호대배경 화소비(Signal-to-Background Gray level Ratio; SBR)를 구함.

④ HPV 유전형 마다 4개 도트의 SBR 값을 구함.

⑤ BG 영상의 경우는 8개 도트의 SBR 값을 구함.

⑥ 총 23 가지(HPV : 22가지 x 4 = 88개, BG : 1가지 x 8 = 8개, 총 96개의 값)의 SBR 값을 가지고 아래와 같이 결과 판정을 함.

(6) 결과 판정

① 음성 판정

- BG의 SBR 값이 모두 2.5 이상 임을 확인함.

- 22가지 HPV 유전형의 SBR값이 2.5 미만일 경우, 본 키트에서 검출이 가능한 22가지 HPV에 대하여 음성으로 판정

② 양성 판정

- BG의 SBR값이 모두 2.5 이상 임을 확인하고

- 각 HPV 유전형의 SBR 값이 2.5 이상일 경우, 해당 유전형의 HPV 감염을 양성 판정. (같은 HPV 유전형 네 도트의 SBR 값이 모두 2.5 이상이어야 함)

- 각 HPV 유전형의 SBR 값이 2.5 미만일 경우, 해당 유전형의 HPV 감염을 음성으로 판정.(같은 HPV유전형 네 도트의 SBR 값이 모두 2.5 미만이어야 함)

③ 판정 불가

- 8개의 BG의 SBR 값 중 1개 이상의 SBR 값이 2.5보다 작을 경우 판정불가, 재시험함

- 같은 HPV 유전형 네 도트의 SBR 값 중, SBR 값이 2.5 이상 또는 미만인 결과가 동시에 나올 경우 판정 불가, 재시험함