마이에이취피브이칩 - 의약품 상세정보

1) 사용방법 흐름도

2) 사용방법

(1) 시약 준비

가. MyHPV chip 키트는 항상 차광 용기에 냉장(2-8℃) 보관한다.

나. 사용 전에 유전자추출시약용 키트의 10X 인산염완충액 10ml을 증류수 90ml과 혼합하여 1X 인산염완충액을 만든다.

(2) HPV 유전자 추출

가. 검체는 자궁경부세포진이 묻혀진 면봉으로 이를 미리 준비해 놓은 1X 인산염완충액 5ml가 담겨진 15ml conical tube에 넣고 1분간 진탕 혼합하여 세포진을 떼어낸 후 면봉을 제거하여 3000rpm에서 10분간 원심 분리한다.

나. 상층액을 제거한 뒤 침전물에 1X 인산염완충액 1ml을 분주하여 1분간 진탕 혼합하여 침전물과 혼합시킨 후, 6,000rpm에서 10분간 원심 분리한다.

다. 상층액을 제거한 뒤 10회간 전도혼화한 유전자추출 용액 0.1ml를 침전물에 넣고 1분간 진탕 혼합하여 침전물과 혼합시킨 후, 100℃에서 20분간 가열한다.

라. 실온에서 5분간 방치한 후, 14,000rpm에 5분간 원심분리시켜서 분리된 상층액 0.1ml을 PCR에 사용하거나 사용시까지 냉장고에 보관한다.

(3) 유전자 증폭(polymerase chain reaction, PCR)

- 모든 PCR 과정은 각각의 조건에서 Appliedbiosystems사의 GeneAmp PCR system 9700 기기를 사용한다.

- 1st PCR시에 premix Ⅰ과 premix Ⅲ 혼합액을 각각 다른 튜브를 사용하여 같은 조건에서 동시에 유전자 증폭을 한다.

가. 1st PCR

가) premix Ⅰ (DNA PCR 혼합액)를 사용한 1st PCR

- 2).(2)항의 swab 검체에서 추출된 유전자와 양성 및 음성대조를 주형 DNA로 사용하여 다음의 조건에서 PCR을 실행한다.

나) premix Ⅲ (DNA PCR 혼합액)를 사용한 PCR

- 2).(2)항의 swab 검체에서 추출된 유전자와 양성 및 음성대조를 주형 DNA로 사용하여 다음의 조건에서 PCR을 실행한다.

- premix Ⅲ DNA PCR mixture를 사용한 PCR의 경우, TBE 완충액 100ml에 아가로스 2.5g을 용해시켜 2.5% 아가로스 젤을 제조한 후, PCR 산물 3.0㎕와 6X loading dye 0.5㎕를 혼합하여 150V에서 10분간 전기영동하여 PCR 증폭산물로 250bp 생성여부를 확인한다.

밴드가 생성되지 않은 경우, 재검하거나 검체를 다시 채취하도록 한다.

나. 2nd PCR

가) premix Ⅱ (DNA PCR 혼합액)를 사용한 2nd PCR (Nested PCR)

- 가.가)항의 premix Ⅰ을 사용하여 생성된 PCR 산물을 주형 DNA로 사용하여 다음의 조건에서 PCR을 실행한다.

(4) MyHPV chip과의 교잡반응(hybridization)

가. 2nd PCR 생성물중 5.0㎕를 95℃에 5분간 denaturation 시킨다.

(MyHPV chip 한 장당 양성대조, 음성대조를 항상 사용한다.)

나. 교잡반응용액 35.0㎕를 사용 직전에 37℃에 5분간 Incubation 시킨다.

다. 위의 1), 2)를 잘 혼합하여 MyHPV chip 위의 각 well에 분주하고 스카치^TM 테이프로 고정한다. (이때, 분주과정에서 공기방울이 생기지 않도록 주의한다. )

라. 빛이 차단된 43℃ 항온조에서 4시간동안 반응시킨다.

(5) 칩 세척

가. 교잡반응이 끝난 슬라이드는 부착된 sealer를 제거한다.

나. 2x SSC(0.3M NaCl, 0.03M sodium citrate), 0.1% SDS가 포함된 완충용액 100ml에서 5분간 2회에 걸쳐 세척한다.

다. 0.2x SSC(15mM NaCl, 1.5mM sodium citrate) 용액 100ml에서 5분간 1회 세척한다.

라. 0.1x SSC(15mM NaCl, 1.5mM sodium citrate) 용액 100ml에서 5분간 1회 세척한다.

마. 세척된 슬라이드를 실온에서 말린다.

바. 사용 전, 사용 후 슬라이드는 실온, 암실에서 보관한다.

(6) 결과 분석(스캐닝)

가. 스캐너 사용방법 및 조작 순서

가) ScanArray

(가) ScanArray의 전원를 켠다.

(나) ScanArray 전면부의 전원 LED에 녹색이 들어온 후, Ready LED가 오렌지색에서 녹색이 되는지 확인한다.

(다) 컴퓨터의 전원을 켠 후, 바탕화면에서 ScanArray 프로그램 아이콘을 더블 클릭하여 실행한다.

(라) ScanArray 프로그램의 첫 화면에서 Instruments 디렉토리에 연결된 ScanArray 4K/LITE를 더블 클릭하여 Instrument List창을 띄운다.

(마) Instrumens List 창에서 실험에 사용할 레이저(레이저1)를 선택하여 예열시킨다.

(바) 도구 바의 슬라이드 삽입 아이콘을 클릭하여 스캔할 슬라이드를 ScanArray 본체에 삽입한다. 걸리는 부분까지 삽입 후, 다시 슬라이드 삽입 아이콘을 클릭하여 슬라이드를 기기 안으로 이동시킨다. "Sample Loaded" 메시지를 확인한다.

(사) 도구 바에 있는 start 버튼을 클릭하여 Acquisition Condition을 조작할 수 있는 창을 연다

(아) "Preview of Area"에서 마우스 끌기을 이용하여 scan할 영역을 지정한다.

(자) "Quick Scan" 50um 부분을 클릭하여 선택한다.

(차) "Fluorophore Image" ; 슬라이드에 사용한 dye인 Cy5를 선택한다.

(카) "Auto-Save Image" Scan하는 영역을 자동으로 저장한다. Default 값으로 항상 지정되어 있다.

(타) "Experiment Set Name" ; 스캔하고자 하는 Image의 폴더 이름을 정한다.

(파) "Acquire" 버튼을 클릭하면 스캐닝이 시작된다.

(하) 스캔한 Image를 분석하기 위해 QuantArray 프로그램을 이용한다.

나) QuantArray

(가) 바탕화면에서 QuantArray 아이콘을 더블 클릭하여 QuantArray를 실행시킨다.

(나) protocol wizard를 사용하여 protocol을 만든다.

a. protocol wizard는 4단계로 구성된다.

1단계 : 분석할 Image의 Array Pattern을 결정한다.

a) protocol wizard에서 pattern wizard*를 실행시켜서, 슬라이드에 탐침된 spot의 지름과 spot의 수, 간격 등의 정보를 자동으로 설정되도록 한다.

*pattern wizard(지시문이 제공되며, 그 지시문에 따라 실행한다.)

(a) 1~3단계 : spot의 지름를 설정하는 단계로 임의의 한 spot의 좌, 우측과 중심에 정확히 마우스로 십자선을 설정해 준다.

(b) 4~7단계 : spot의 간격을 설정하는 단계로 spot의 중심에 정확히 마우스로 십자선을 설정해 준다.

(c) 8~12단계 : array간의 간격과 array의 수를 설정하는 단계로 정해진 spot의 중심에 정확히 마우스로 십자선을 설정해 준다.

- 12단계를 모두 완료하였을 경우 탐침된 spot의 pattern은 자동으로 설정된다.

2단계 : grid & spot elasticity를 결정한다.

a) grid elasticity : 값이 클수록 array에서 spot의 위치 파악범위가 넓게 설정되고, 값이 작을수록 spot의 위치 파악 범위가 좁게 설정된다.

b) spot elasticity : 값이 클수록 spot의 크기의 파악 범위가 넓게 설정되고, 값이 작을수록 spot의 size(diameter)의 파악 범위가 좁게 설정된다.

3단계 : 분석 방법을 결정해 주는 단계이다.

a) Adaptive를 선택한다. (현 version의 QuantArray에서는 histogram과 fixed circle의 기능은 사용할 수 없다.)

4단계 : 분석한 정보를 저장할 파일 이름을 넣어준다.

a) 확장자가 .txt로 할 경우 일반 text 화일로 저장되고 .xls로 할 경우 excel 파일로 저장된다.

(다) 이미지 분석

a. 분석할 Image 화일들은 메뉴바의 파일 안에 있는 open image를 통하여 불러온 후, contrast를 조절하여 잘 볼 수 있게 한다.

b. 왼쪽에 위치한 analysis step에 나온 순서대로 분석을 시작한다.

a) Register Images step : 2개 이상의 Image를 동시에 분석할 경우 사용한다.

b) Specify location step : Image 상에 사각형 상자가 나타나며, 이 사가가형 상자를 스캐닝한 Image상의 첫 번째 열, 첫 번째 행에 위치한 spot에 존재하도록, 마우스로 움직인다.

c) Edit Pattern Step : Array Pattern의 위치를 조절하여 Array Pattern과 spot Image가 일치하도록 한다.

d) Locate Pattern Step : 각각의 spot마다 사각형 상자가 생기고, 마우스를 움직여서 각 spot이 사각형 상자 안에 들어가도록 위치를 보정한다. Start Locate 버튼을 누르면 분석이 시작된다.

e) View Report Step : 왼쪽의 Image창에서 각각의 spot을 더블 클릭하면 그 spot의 분석 정보(spot intensity, background intensity, ratio 등)를 볼 수 있다.

f) Export Data Step : 분석이 끝난 정보는 text 화일이나 excel 화일로 저장된다.

(라) 기기를 종료하기 위하여 화면의 도구 바에서 선택했던 레이저의 아이콘을 눌러 레이저를 끈 후, 도구 바 상단의 슬라이드 삽입 아이콘을 클릭하여 기기 안의 슬라이드를 꺼낸다.

- 나. 스캐너 사양 및 분석 조건

가) 스캐너 사양

나) 스캐너 분석 조건

(7) 결과 판정

다음의 표에서와 같이 β-globin의 위치를 기준으로 좌측은 저위험군, 우측은 고위험군이며 아래쪽에서부터 낮은 숫자의 HPV형이 탐침되어 있으므로, 형광이 발현된 위치를 확인하여 형광의 SNR값을 구한 후, HPV형을 판정한다.

SNR 값은 HPV 형별로 2개씩 탐침된 탐촉자 각각의 값, β-globin은 총 9개의 탐촉자 각각의 값으로 판정하며, 분석시에는 분석 프로그램에서 요구하는 값을 표시함으로써 SNR 값이 자동 계산된다.

- 분석시 필요한 값

1. 탐촉자 하나의 좌측 표시

2. 탐촉자 하나의 우측 표시

가. 단독감염 ; β-globin 탐촉자 9개와 그 외의 19쌍의 탐촉자 중 1쌍의 탐촉자에서 SNR값은 각각 5.0 이상이어야 한다.

나. 중복감염 ; β-globin 탐촉자 9개와 그 외의 19쌍의 탐촉자 중 2쌍 이상의 탐촉자에서 SNR값은 각각 5.0 이상이어야 한다.

다. 음      성 ; β-globin 탐촉자 9개의 SNR값은 5.0 이상이며, 그 외의 19쌍의 탐촉자의 SNR값은 모두 5.0 미만이어야 한다.

(본 MyHPV 칩 키트는 HPV subtyping만을 결정하는 키트이다.)

(8) 시스템 적합성

HPV 칩 검사시에는 매 칩마다 양성 대조와 음성 대조를 동시에 검사하여, 양성 대조는 9개의 β-globin 탐촉자와 두개의 16형 탐촉자에서 각각의 SNR값이 5.0 이상이어야 하고, 음성 대조는 9개의 β-globin 탐촉자는 5.0 이상이어야 하고, β-globin 탐촉자를 제외한 나머지 탐촉자에서 각각의 SNR값은 5.0 미만이어야 한다.