유싸이트플러스 - 의약품 상세정보

1) 컬렉션 센터에서(Collection Center) :

중요: 생물학적 샘플의 질적 저하 때문에 아침 첫 소변은 피한다. 낮 동안에 소변을 받을 수 있도록 알려

준다. 환자에게 단식을 요구하지 않는다.

소변을 채취한 후 바로 80mL 소변 용기에서 20-40mL을 취한다. 이 샘플에 동량의 50% 에탄올이나

50% 이소프로판올을 첨가한다. 용기를 단단히 닫고2 · 3회 거꾸로 하여 혼합시킨다.

가능한 빨리 검사실에 샘플을 보낸다. 샘플이 운송될 때 까지는 2-8℃ 냉장상태를 유지한다.

2) 검사실에서(Laboratory)

중요: 검사는 샘플 채취 후 7일 이내에 반드시 행해져야 한다. 샘플은 검사하기 전까지는 반드시 2-8℃

를 유지해야 한다.

3) 검사실에 샘플이 접수됐을 때, 소변과 알코올의 혼합물에 고정액(fixative solution) 1 mL을 첨가한다.

용기를 단단히 닫고 고정제 용액이 완전히 확산시키기 위하여 힘있게 흔든다. 고정된 샘플은 여과하기

전에 실온(18-30℃)에서 15분간 배양(incubation)시킨다. 만약 즉시 실험을 하지 않을 경우에는, 샘플

을 2-8℃ 냉장고에 보관한다.

1) 반응 정지액(Blocking solution) : 바로 사용 가능한 용액으로 50건의 검사가 충분하다. 이 용액은 형광

발광 라벨링 전에 비 특이적 위치의 저지에 사용된다. 점적 병은 방울당 ~ 45㎕를 적출시킨다. 2-8℃

냉장에 보관한다. 병에 명시한 유효기한이 경과한 것은 사용하지 않는다.

2) 항체 용액(Antibody solution) : 바로 사용 가능한 용액으로 50건의 검사가 충분하다. 점적 병은 방울당

~45㎕를 적출시킨다. 2-8℃ 냉장에 보관한다. 병에 명시한 유효기한이 경과한 것은 사용하지 않는다.

3) 샘플 고정액(Sample fixative) : 파우더의 형태로 2개의 밀봉된 패킷(packet)에 담겨져 있다. 한 패킷은

50소변 샘플을 하기에 충분하다.

준비: 용기에, 탈염(脫鹽, demineralised)한 물에 한 패켓의 파우더를 용해시켜 50mL의 양을 만든다.

파우더가 완전히 용해될 때까지 혼합시킨다. 이 용액을 용해의 보조수단으로 37℃ water·bath에서 가열할

수 있다. 이 용액은 2-8℃ 냉장에 보관한다. 패킷에 명시한 유효기한이 경과한 것은 사용하지 않는다.

파우더 고정액은 용해된 날로부터 9개월간 안정하다.

4) 양성 대조(Positive control) : 항원의 양쪽 타입이 존재하는 부유액속의 고정된 세포를 포함한 시약으로

바로 사용 가능하다. 2-8℃ 냉장에 보관한다.

5) 음성 대조(Negative control) : 두 가지 항원 중 어떤 것도 존재하지 않는 부유액속의 고정된 세포를

포함한 시약으로 바로 사용 가능하다. 2-8℃ 냉장에 보관한다.

1. 양성 및 음성대조 슬라이드 준비

매번 염색시 마다 양성/ 음성대조 슬라이드를 제작하여야 한다.

- 만일 양성대조 슬라이드가 충분한 염색이 되지 않았다면, 검체가 사용된 슬라이드는 부적합한 것으로

간주된다.

- 만일 음성대조 슬라이드에서 약하거나 광범위한 배경보다 강한 강도(intensity)를 보여지고,

brightfield 면에서 세포와 연관된 것으로 확인되거나 표적물(漂積物,debris)과의 연관이 없다면 시약

또는 실험 과정상의 부적합함으로 여겨지고, 검체가 사용된 슬라이드는 부적합한 것으로 간주된다.

중요: 진행하기 전에 완전하게 혼합하고 마이크로파이펫으로 세포를 해리시킨다.

(1) 한 슬라이드당 양성 및 음성 대조를 표시한다.

(2) 슬라이드상에 다이아몬드 팁이 있는 연필로 20mm 지름 원을 그린다.

(3) 마이크로파이펫으로 양성대조 부유물로부터 20㎕를 취하여 원 안에 엷게 바른다.

(4) 즉시 슬라이드 위에 약 15cm 거리를 두고 고정액(50% 이소프로판올 용액)을 분무기로 뿌린다.

(5) 음성 대조 부유물에 대해서도 위의 두 가지 단계를 반복한다.

(6) 두 개의 슬라이드를 실온(18℃-30℃)에서 10~15분간 말린다.

(7) 이 슬라이드들은 uCyt+ 실험 절차를 진행하기 전에 완전히 말라있어야 한다.

(8) 나머지 실험절차를 위하여 다른 슬라이드와 함께 이 두 개의 슬라이드를 위치시킨다.

2. 소변 샘플의 여과(filtration)

1) 필터 홀더 (filter holder) 제작

(1) 멤브레인 필터를 필터 홀더에 끼운다. 멤브레인 필터의 흐릿한 면과 번뜩거리는 면 중 번뜩거리는

면이 검체와 접촉하도록 한다.

(2) 고무 링을 끼운 후 필터 홀더를 돌려 끼워 완전히 조립한다.

2) 여과장치의 준비

(1) Syringe filtration이나 Vacuum chamber filtration 중 하나의 여과장치를 준비한다.

(2) 시레인(silane)·처리된 슬라이드에 각 샘플을 표기한다.

- 중요: 만약 샘플이 냉장이라면, 여과 절차를 진행하기 전에 최소한 30분 이상을 실온(18~30℃)

에 꺼내 놓는다샘플을 항온수조기(water bath)에서 10분까지 따뜻하게 한다. 오래 가열하거나

37℃ 이상이 되지 않게 한다.

3) 실린지를 통한 여과(양압, positive pressure)

(1) Syringe로 흡입하기 전에 검체 용기를 테이블에 가볍게 두드리고 흔들어 섞어준다.

(2) Syringe로 검체 흡입(60ml Syringe 사용)

(3) 앞서 제작된 Filter Holder를 Syringe에 끼운다.

(4) Plunger를 밀어 압력을 가한다. Plunger가 밀리지 않을 때까지 압력을 가한다.

(5) Filter Holder를 Syringe에서 분리한다.

- 소변이 필터를 통해 여과되는 동안에는 방해 받지 않아야 한다.

- 필터가 마르는 것을 방지하기 위하여 소변의 작은 양이 필터에 남아있게 한다.

4) Vacuum chamber filtration : 사용자 설명서 참조.

3. 슬라이드에 세포 옮기기

중요: 필터가 마르는 것을 방지하기 위하여 가능한 한 빨리 아래 단계를 실행해야 한다.

(1) 핀셋을 이용하여 필터를 제거한다.

(2) 필터를 떼어낸다. 세포가 있는 표면(shiny side)을 확인한다.

(3) 필터를 식별한 슬라이드와 일치되게 놓는다.

(4) 소변에 접촉하는 필터의 빛나는 부분(소변이 접한 곳)이 이제는 슬라이드의 표면에 접촉되게 하는

동안 이 필터는 식별된 슬라이드와 일치하게 놓는다.

(5) 그 위에 흡수지(Kimwipes)를 두 번 정도 접어 올린 후 약간의 PBS를 이용하여 적신다.

(6) 주먹 쥔 손으로 흡수지 (Kimwipes)위에서 지긋이 힘을 주어 필터에 있는 세포들이 슬라이드로

transfer되도록 한다. 이때 가하는 힘이 필터 전반에 전달되도록 한다.

(7) 흡수지(Kimwipes)를 제거하고 슬라이드 위의 필터를 천천히 들어올려 제거한다.

(8) 곧바로 세포가 고정되도록 spray fixative solution을 뿌린다. (약 15cm 거리 유지)

(9) dry 시키기 위해 약 10·15분간 슬라이드를 실온에 방치.

(10) 다음의 면역반응(immunoreaction) 과정을 위해 슬라이드 (samples & controls)를 슬라이드 홀더에

끼운다.

(11) 면역반응을 진행한다.

- 즉시 다음 단계인 면역반응 단계(immunoreaction procedure)를 진행할 것을 권고한다. 만약

이것이 가능하지 않다면, 슬라이드는 ·20℃에서 (빛과 먼지를 피하고, 검체를 채집한 날로부터

일주일을 초과하지 않는 범위에서) 3일까지 보관이 가능하다.

4. 면역 반응

중요: 이 단계를 진행하기 전에 PBS와 PBS/Tween 20 용액이 실온(18℃·30℃) 상태인지 확인한다.

1) 전 처리

(1) 사용하기 전에 Harris 헤마톡실린을 여과시킨다.

(2) 초산을 마지막 농도가 4%가 되도록 첨가한다.

(3) 슬라이드 용기에 슬라이드(샘플과 컨트롤)를 위치시킨다.

(4) 아래의 8개의 액조(液槽, baths)에서 전 처리를 한다.

- 에탄올 80 % (10번 담금질)

- 에탄올 70 % (10번 담금질)

- 에탄올 50 % (10번 담금질)

- 증류수 (3번 담금질)

- 헤마톡실린(hematoxylin) + 4% 초산(90초)

- 증류수 (10번 담금질)

- 증류수 (10번 담금질)

- 증류수 (10번 담금질)

(5) 물기를 살짝 털어 제거한다.

(6) 슬라이드를 습윤액조(humid chamber)위에 하나씩 나란하게 올려놓는다.

(7) 세포가 도말된 면이 위로 향하는지 확인한다.

2) 반응 정지액(Blocking Solution)

(1) 세포가 도말된 부분에 반응정지액 4 방울을 떨어뜨린다.

(2) 세포 영역 전반에 반응정지액이 골고루 퍼지게 한다.

(3) humid chamber를 닫고 실온(18˚C · 30˚C)에서 15 ± 5분간 incubation한다.

(4) 슬라이드상의 물기를 떨어뜨려 제거한다. 절대로 슬라이드를 dry시키지 않는다.

3) 항체 용액(Antibody Solution)

(1) 세포가 도말된 부분에 항체 용액 4 방울을 떨어뜨린다.

(2) 세포 영역 전반에 항체 용액 이 골고루 퍼지게 한다.

(3) humid chamber를 닫고 실온(18˚C · 30˚C)에서 60 ± 5분간 incubation.

(4) 시간 엄수. 시간이 연장될 경우 과다한 background staining

- 중요 : 슬라이드를 빛으로부터 차단한다.

4) 린스(Rinse)

(1) PBS Tween 20을 이용하여 rinse.

- 중요 : Cell zone에 직접적으로 물줄기를 흘려 보내 린스 하지 않는다. 세포가 떨어져 나가는

결과를 초래할 수 있다.

(2) 여분의 버퍼용액 제거

(3) 슬라이드 홀더에 꽂아 PBS Tween 20 액조(液槽, baths)에 담근다.

(4) 빠르게 홀더를 10회 담근다.

(5) 슬라이드를 PBS Tween 20과 접촉할 수 있게끔 3분간 방치한다.

(6) 10회 담그기를 반복한다.

(7) PBS Tween 20 액조로 옮겨 슬라이드를 다시 10회 담그기를 한다.

(8) 용액이 들어있는 용기에 3분간 방치한다.

(9) PBS 용액에 10 회 이상 담그기를 반복한다.

(10) mounting 하기 전까지 PBS 용액에 그대로 방치한다.

5) 마운팅(Mounting)

(1) 각 커버슬립 위에 마운팅 용액을 1 방울 떨어뜨리고 액조안에 있는 슬라이드를 하나씩 꺼낸다.

(2) 슬라이드의 세포 영역에 커버슬립을 위치시킨다.

(3) 슬라이드와 커버슬립 사이의 공기방울을 조심한다.

(4) 빛 차단을 위하여 덮개가 있는 슬라이드 랙(slide rack)에 보관한다.

(5) 슬라이드는 마운팅 후 바로 판독에 들어간다. 그렇지 않을 경우, 2·8℃에서 7일간 보관 가능하다.

그 이후에는 형광강도가 약해지기 시작한다.

(6) 현미경 판독하기 전 약 15분간 실온(18·30℃)에 방치한다.

- 참고: 만약 수직(vertical) 보관을 계획한다면, 보관하기 전 24시간 동안 수평한 위치에서 슬라

이드를 말린다

- 소변에서 채취한 세포의 면역형광 슬라이드의 판독은 현미경에 대한 사용법을 교육받았고 소변의 다양한

구성물 (적혈구, 염증성 세포, 결정(crystal), 점액)을 식별 가능한 유경험자

- 중요: 절대로 슬라이드에 자외선 램프를 과도하게 쏘이지 않는다. 이는 형광의 강도를 감소시키는 결과를

초래한다.

- 참조: 형광이미지는 Technical Manual · Interpretation of staining 참조한다.

1. 컨트롤 슬라이드

1) 음성대조 슬라이드(Negative Control Slide) : 오렌지 색을 띄거나 과립상태 (granulation)가 존재

하지 않는다.

2) 양성 대조 슬라이드(Positive Control Slide)

(1) 녹색 형광(Green fluorescence) : 22·55% 양성 형광세포에서 평균 ++/+++의 강도가 나타난다.

(2) 적색 형광(Red fluorescence) : 13·40% 양성 형광세포에서 평균 ++/+++의 강도가 나타난다.

(3) 이중필터를 사용한 경우에는 적색과 녹색의 형광이 가끔 부분적으로 노랑색을 띈다.

2. 환자 샘플 슬라이드

1) 음성 transitional cell : 흐릿한 외관이나 과립상태(granulation)가 존재하지 않는다.

2) 양성 transitional cell : 형광과립상태가 선명하게 나타난다.

- 과립상태는 최소한 세포의 절반 이상이 눈에 보여야 한다.

- 강도는 음성 세포와 비교하기 위하여, 녹색이나 적색 과립상태의 존재가 의심할 여지 없이 평가

되어야 한다.

3) 음성처럼 생각되는 경계치 적색 transitional cell(Borderline red transitional cell considered

negative): 음성 세포와 비교해서 밝은 오렌지 색을 띈다. 가끔은 소수의 과립상태에서 나타나지만

형광이 반 이하를 덮고 있다.

유싸이트 플러스(uCyt+)는 이미 방광암으로 진단된 환자의 소변에서 박리된 종양세포의 검출을 위하여 전반

적인 민감도를 향상시키기 위한 목적으로 세포학(cytology)과 병행하여 사용하기 위한 정성 직접 면역세포형

광법(direct immunocytofluorescence assay)이다.

유싸이트 플러스(uCyt+)는 비뇨세포학(urinary cytology)과 세포검사(cytoscopy)와 함께 병행하여 방광암

관리를 위한 조력으로 사용한다.

1. 방광내 치료 (화학요법, 면역요법, 방사선용법)의 영향에 대한 검사의 특이도에 대해서는 설정 되어 있지 않다.

2. 인종이나 흡연에 대한 영향에 대한 검사의 민감도와 특이도에 대해서는 설정되어있지 않다.

3. 의료장비에 대한 검사의 민감도와 특이도에 대해서는 설정되어있지 않다.

4. 아래의 자격을 갖춘 자만이 검사를 실행한다.

- 면허를 소지한 병리학자 또는 세포담당기사

- 기술교본(Technical Manual)에 기술한대로 성공적으로 완벽하게 자격절차를 갖춘 자

- 소변에서 채취한 세포의 면역형광 슬라이드의 판독은 현미경에 대한 사용법을 교육받았고 소변의

다양한 구성물 (적혈구, 염증성 세포, 결정(crystal), 점액)을 식별 가능한 유경험자

5. 이 제품은 flow cytometry를 위해 고안되지 않다.

6. 많은 양의 점액은 형광의 background 레벨을 증가시켜 양성 세포를 가린다. 크리스탈은 비특이성 형광을 나타낼 수 있다. 형광물체의 본질은 항상 brightfield 에서 확인되어야 한다.

7. 전형적인 세포학으로서, 환자의 샘플이 오직 약간의 경계치의 양성(boardline·positive) 붉은 형광을 포함하고 있는 의심스러운 결과는 판독에 주의하여야 한다.

8. 어떠한 염색이나 그것의 결여에 대한 임상판독은 형태학적인 연구나 적합한 컨트롤로 보완하며 환자의 임상내력의 전후 관계나 자격을 갖춘 병리학자에 의한 다른 진단 검사에 의하여 평가된다.

9. 이 키트의 항체는 소변에서 방광암을 검출하기에 적합하게 미리 희석되어있다. 여기에 또 희석을 하는 것은 항원의 염색을 손실되게 하는 결과를 나타낸다.

10. 이 검사는 urinary diversion이나 내부장기를 이용한 방광복원을 한 환자에게는 추천하지 않는다.