굿젠HPV DNA지노타이핑칩 - 의약품 상세정보

1.1. LaboPass™ Tissue Mini DNA 추출 키트를 이용하여 임상 검체로부터 게놈 DNA를 추출한다.

1.2. HPV에 특이적인 프라이머 세트(L1 프라이머, L2 프라이머), HBB프라이머세트(H1 프라이머, H2 프라이머)와 PCR 프리믹스을 이용하여 추출한 게놈 DNA로부터 중합 효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 표적 DNA를 증폭한다.

1.3. 굿젠 HPV DNA 지노타이핑 칩을 이용하여 적절한 조건에서 교잡 반응을 수행한다.

1.4. GenePix 4000B(Axon, USA)를 이용하여 스캔한다.

2.1. 검체로부터의 게놈 DNA 추출

가. 자궁경부에서 채취한 검체로부터의 게놈 DNA 추출

- 검사 준비

1) 항온수조를 56℃로 미리 준비한다.

2) 본 제품에서 제공하는 게놈 DNA 추출 키트의 한 튜브 당 검체 처리량은 세포 5×10⁶ 개를 처리할 수 있다. 따라서 검체액 1∼1.5 ㎖이 적당하다.

3) 완충용액 BW(농축액 상태)에는 100% 에탄올을 93 ㎖을 첨가한 후 사용하며 실온 보관한다. 개봉 후, 에탄올이 증발하지 않게 반드시 뚜껑을 잘 닫는다.

4) 완충용액 NW(농축액 상태)에는 100% 에탄올을 92 ㎖을 첨가한 후 사용하며 실온 보관한다. 사용 후, 에탄올이 증발되지 않게 반드시 뚜껑을 잘 닫는다.

5) 완충용액 TB는 사용하기 전 침전물이 있는지 확인하고, 만약 침전물을 발견 시에는 60℃ 항온 수조에서 녹여 제거할 수 있다.

6) 위의 시약들은 개봉 후, 실온 암소에서 1 년간 보관이 가능하며, 각 시약에 대한 첨가물을 첨가한 후에도 실온 암소에서 1 년간 보관이 가능하다.

7) 본 키트에서 제공하지 않는 필요한 시약 및 기자재

: 1×PBS, 100% 에탄올, 원심분리기, vortex, 항온수조.

- 검사 방법

1) 1.5 ㎖ 튜브에 채취한 검체용액을 1.5 ㎖을 옮겨 미세원심 분리기에 넣고, 13,500 ×g에서 2 분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.

2) 상층용액을 제거하고 500 ㎕ 1×PBS로 첨가한다.

3) 교반기(Vortex)를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.

4) 13,500 ×g에서 2 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.

5) 200 ㎕ 완충용액 TL를 첨가한다.

6) 20 ㎕ 프로테이나제 K를 첨가한 후, 교반기(vortex)를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

7) 항온수조 56℃에서 30 분간 정치 반응한다.

8) 반응이 끝난 튜브는 6,000 ×g이상에서 10 초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

9) 400 ㎕ 완충용액 TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 6,000 ×g이상에서 10초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어있는 용액을 떨군다.

10) 스핀 컬럼을 수거용 튜브에 장착한 후, 위의 반응용액을 스핀 컬럼에 넣는다.

11) 6,000 ×g에서 1분간 원심분리한다.

12) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.

13) 700 ㎕ 완충용액 BW를 첨가하고 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.

14) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.

15) 500 ㎕ 완충용액 NW를 첨가하고 13,500 ×g에서 3 분간 원심 분리한다.

16) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5 ㎖ 튜브를 장착한다.

17) 200 ㎕ 완충용액 AE 나 정제수를 컬럼의 중앙에 첨가하고, 2 분간 실온에 방치한다.

18) 6,000 ×g에서 1 분간 원심분리한다.

19) 추출된 게놈 DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20℃에 보관할 수 있다.

20) 추출된 게놈 DNA는 0.8% 한천 젤에 전기 영동하여 UV하에서 확인 가능하다.

나. 파라핀 고정 검체로부터의 게놈 DNA 추출

- 검사 준비

1) Heat block을 37℃와 60℃로 준비한다.

2) 완충용액 BW(농축액 상태)에는 100% 에탄올을 93 ㎖을 첨가한 후 사용하며 실온 보관한다.

3) 완충용액 NW(농축액 상태)에는 100% 에탄올을 92 ㎖을 첨가한 후 사용하며 실온 보관한다.

4) 완충용액 TB는 사용하기 전 침전물이 있는지 확인하고, 만약 침전물이 발견 시에는 60℃ 항온 수조에서 녹여 제거할 수 있다.

5) 완충용액들은 개봉 후, 실온 암소에서 1 년간 보관이 가능하며, 각 시약에 대한 첨가물을 첨가한 후에도 실온 암소에서 1 년간 보관이 가능하다.

6) 프로테이나제 K는 -20℃ 냉동고에 두고 사용하며, 보관기간은 1 년간 사용 가능하다.

7) 본 키트에서 제공하지 않지만 필요한 시약 및 기자재

: 자일렌, 100% 에탄올, 원심분리기, vortex, heat block

- 검사 방법

1) 파라핀으로 고정된 검체를 마이크로 절단기를 이용하여 20 ㎛ 두께로 잘라내어서 이용할 수 있으며, 일반 수술용 칼을 사용하여 얇게 저미듯이 박리하여 사용할 수 있다.

2) 1.5 ㎖ 튜브에 위의 검체를 옮긴다.

3) 1.2 ㎖ 자일렌을 첨가하여 2 분간 vortex로 강하게 섞어 준다.

4) 13,500 ×g에서 5 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.

5) 1.2 ㎖ 에탄올을 첨가하여 2 분간 vortex로 강하게 섞어 준다.

6) 13,500 ×g에서 5 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.

7) 파라핀을 완전히 녹여 내기 위해서 과정 3)에서 5)을 반복한다.

8) 검체가 든 튜브를 37 ℃에서 15 분간 방치하여 에탄올을 증발시킨다.

9) 튜브에 남겨진 검체에 200 ㎕ 완충용액 TL를 첨가한다.

10) 20 ㎕ 프로테이나제 K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

11) 항온수조 56 ℃에서 30 분간 정치 반응한다.

12) 400 ㎕ 완충용액 TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 6,000 ×g이상에서 10 초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

13) 스핀 컬럼을 수거용 튜브에 장착한 후, 위의 반응용액을 스핀 컬럼에 넣는다.

14) 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.

15) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.

16) 700 ㎕ 완충용액 BW를 첨가하고 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.

17) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.

18) 500 ㎕ 완충용액 NW를 첨가하고 13,500 ×g에서 3 분간 원심 분리한다.

19) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5 ㎖ 튜브를 장착한다.

20) 200 ㎕ 완충용액 AE 나 정제수를 컬럼의 중앙에 첨가하고, 2 분간 실온에 방치한다.

21) 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.

22) 추출된 게놈 DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20 ℃에 보관할 수 있다.

23) 추출된 게놈 DNA는 0.8% 한천 젤에 전기영동 하여 UV하에서 확인 가능하다.

2.2. HPV 칩 반응을 위한 PCR

가. 검사 준비

1) 각 프라이머에 정해진 양만큼 정제수를 첨가하여 완전히 녹인다. 완전히 녹인 후에는 -20℃에 암소 보관하여 3 개월간 유효하다.

- 정제수 첨가량은 다음과 같다.

- 위의 첨가 되는 정제수의 양은 제조 롯트마다 달라질 수 있다. 이는 각 제조된 키트에 동봉한 사용 설명서를 참조한다.

1) L2, H2 프라이머의 경우, cy5로 말단이 수식되어 있어 빛에 약하므로 은박 호일로 싸서 -20℃ 냉동 보관한다. 정제수에 녹인 후에는 -20℃에 보관하여 3 개월간 유효하며, 적정량을 분주하여 사용하는 것이 바람직하다. 냉동과 해동을 자주할 경우, cy5의 수식이 파괴되어 신호 세기가 약해질 수 있다.

2) 제공된 프리믹스는 -20℃에 보관하여 1 년간 유효하며, 보관 중 튜브 벽면에 서리가 생길 수 있다. 이는 6,000 ×g에서 30 초간 원심 분리하여 프리믹스 시약을 튜브 바닥에 모은 다음 사용할 수 있다.

3) 본 키트에서 제공하지 않지만 필요한 시약 및 기자재

- 정제수, PCR 기기(T3, Biometra, Germany)

나. 검사 방법

각 반응 튜브의 조성은 다음과 같다.

- L1/L2와 H1/H2의 PCR 조성은 위와 동일하다

1) 한 검체당 2 개씩 프라이머 L1, L2 및 H1, H2의 프리믹스를 얼음 위에 준비한다.

2) 프라이머 L1, L2 및 H1, H2에 각각에 대한 2 개의 혼합용 튜브를 준비한다.

3) 프리믹스용 1.5 ㎖ 튜브에 필요 양의 정제수를 각각 넣는다.

4) 각 혼합용 튜브에 필요한 개수에 해당하는 프라이머 세트(L1과 L2 세트, H1과 H2 세트)를 첨가하여 잘 섞는다.

5) 위 과정에서 준비한 L과 H 프라이머 혼합액을 각각의 프리믹스 튜브에 각각 10 ㎕씩 분주한다.

6) 주형(게놈 DNA)를 프라이머가 첨가된 프리믹스튜브에 각각 5 ㎕를 첨가한 후, 잘 섞어준다.

7) 각 혼합액 튜브는 간략하게 원심분리후, PCR 장치(T3 Biometra Inc. Germany)에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.

다. 선택 사항 - HPV 증폭 DNA의 확인

증폭된 DNA는 다음과 같이 2% 한천 젤을 이용하여 5 ㎕를 전기영동으로 확인 가능하다. 전기영동 전압 100 volt로 약 30 분간 수행하여 HPV L1은 185 bp, HBB는 110 bp 길이의 PCR 증폭산물을 확인 할 수 있다. 표준 전기영동 물질로는 100 bp ladder를 이용한다.

< 증폭된 HPV DNA의 전기영동 결과 예 >

2.3. HPV DNA칩 반응

가. 검사 준비

1) 반응할 PCR산물을 변성시킬 수 있는 95℃의 Heat block을 준비한다.

2) 칩 반응 시에 사용할 48℃의 반응조(Combi-SV12, Fine PCR Inc., USA)를 준비한다. 반응조는 반응 시에 습기가 유지될 수 있도록 물기를 머금은 티슈를 반응조의 가장자리에 놓는다.

3) 제공된 완충용액 S1과 완충용액 S2를 이용하여 다음과 같이 세척 용액1과 세척 용액2를 만든다.

① 세척 용액 1:

5 ㎖ 완충용액 S1, 2 ㎖ 완충용액 S2를 993 ㎖의 증류수와 잘 혼합한다.

② 세척 용액 2:

3 ㎖ 완충용액 S1을 997 ㎖의 증류수와 잘 혼합한다.

③ 위와 같이 만들어진 용액은 실온에서 3 개월간 보관이 가능하다.

4) 세척을 할 수 있는 정방형 용기나 50 ㎖ 반응용 튜브를 준비한다.

나. 교잡 반응

1) 반응할 검체 수만큼 새로운 1.5 ㎖ 혹은 200 ㎕ 용량의 튜브를 준비한다.

2) 위 튜브에 50 ㎕씩 정제수를 분주한다.

3) HPV PCR산물 중 L1은 10 ㎕를 첨가하고, HBB의 PCR산물은 5 ㎕를 첨가하여 잘 섞는다.

4) 위 튜브를 95℃로 준비한 Heat block에 3 분간 방치한다.

5) 위 튜브를 바로 얼음에서 5 분간 방치한다.

6) 반응 튜브를 원심분리기를 이용하여 30 초간 원심분리하여 용액을 떨군다.

7) 위 튜브에 HYB I 용액을 65 ㎕를 첨가하여 피펫으로 잘 섞어 준다.

8) 준비한 반응용액을 칩 표면에 부착된 커버 슬립 위에 있는 주입구(구멍)에 천천히 주입한다.

- 이때 칩과 반응 커버웰 사이에 기포가 있는지 부착이 잘 되어있는지를 확인한다. 혹시 기포가 있다면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어 내어 기포를 제거한다.

9) 48℃ 반응조에서 30 분간 칩을 교잡 반응시킨다.

다. 교잡 반응 후 세척

1) 교잡 반응이 끝나면, 칩에서 커버웰을 제거한다.

2) 미리 준비한 세척 용액 1을 세척용 용기에 반응할 칩이 잠길 수 있게 붓고 반응한 칩을 궤도교반기를 이용하여 실온에서 2 분간, 8 oscillation의 속도로 세척한다.

-만약 반응 칩이 1 개라면, 50 ㎖ 원추형 튜브에 40 ㎖의 세척 용액을 넣고 반응한 칩을 넣은 후, 상하로 2 분간, 분당 50 회의 속도로 흔들어 세척할 수 있다.

- 궤도교반기를 이용하지 않고 수동으로 세척할 경우 세척용기에 세척용액을 반응한 칩이 잠길 수 있게 붓고, 실험대에서 손으로 좌우로 2 분간 분당 50회의 속도로 세척용기를 흔들어 세척 한다.

3) 사용한 세척 용액을 버리고 새로이 세척 용액 2를 넣어 다시 2 분간 세척한다.

4) 세척 후에도 칩에 남은 버퍼를 제거하기 위해 스핀드라이기나 공기 컴프레서를 사용할 수 있다. (간단히 킴와이프 종이로 살짝 덮어 칩에 묻어 있는 버퍼를 제거할 수 있다. 단, 손으로 반응부위를 만져서는 절대 안 된다.)

라. 스캐닝

1) 스캐너의 전원 공급 장치의 전원을 켠다.

2) 윈도우 화면상의 GenePix Pro6.0 아이콘을 작동시킨다.

3) Hard ware diagnostics( 아이콘)창을 활성화시켜, 파장 635에 Laser power 100, PMT800, Pix size 10 ㎛, Lines to average 1, Focus Position 0 ㎛로 세팅한다.

4) 스캐너 문을 살며시 열어 칩의 스티커 부분이 아래로, 반응된 면이 아래로 향하게 하여 장착한다.

5) "Preview scan" 아이콘을 작동하여 스캐닝 하고자 하는 위치의 스캐닝 영역을 조절한다.

6) "Data scan" 아이콘을 실행하여 발색된 시그널을 확인한다.

7) 스캔된 이미지상에서 반응한 부위만 그리드 아이콘 을 실행하여 컬럼 x Row 8x8, 컬럼& Row spacing 375 ㎛, Feature diameter 220 ㎛를 설정한다. 그리드의 이동 시에는 아이콘 을 사용하여 스팟이 있는 부위에 정확하게 그리드를 맞춘다.

8) "Align features in All Blocks" 아이콘 을 실행한다.

9) "Analyze" 아이콘 을 실행한 후, "Results"를 gpr 파일 형태로 저장 아이콘 을 실행시켜 저장 한다.

10) 저장된 gpr 파일 결과를 엑셀프로그램에서 불러와, SBR(각 점작 영상의 화소와 화소를 둘러싼 배경 영상의 화소값 비, Signal-to-Background Gray level Ratio)값을 수식 "F635 Median÷B635 Median"으로 계산하여 구한다. 영상분석에 대한 알고리즘은 별첨 9에 첨부하였다.

11) HPV 유전형 마다 2 개 스팟에 대한 SBR 값을 구한다.

12) HBB의 경우 8 개 스팟에 대한 SBR값을 구한다.

13) 23 종의 스팟에 대한 SBR값(=F635 Median/B635 Median)을 가지고 결과를 판정한다.

2.4. 결과 판정

가. 양성 판정

모든 HBB 8 개 스팟 SBR 값이 2.5 이상이며, 해당 HPV L1 유전형 2개의 스팟 모두 SBR 값이 2.5 이상일 경우, 해당 HPV 유전형에 대해서 양성으로 판단한다.

나. 음성 판정

모든 HBB 8 개 스팟 SBR 값이 2.5 이상이며, 22 종의 HPV 유전형의 SBR값이 모두 2.5 미만일 경우, 본 제품에서 검출이 가능한 22 가지 HPV에 대하여 해당 검체를 음성으로 판단한다.

다. 판정 불가 혹은 재시험

① 모든 HBB 스팟 8 개가 SBR 2.5가 넘지 않을 경우, 검체의 채취부터 재시험한다.

② HBB 스팟 8 개중 1 개라도 SBR이 2.5가 넘지 않을 경우, 검체의 검사부터 재시험한다.

③ HPV 유전형 22 종(동일 유전형 1개 당 2 스팟) 스팟에서, 동일 유전형 스팟 2 개중에 1 개라도 SBR값이 2.5 이상 또는 미만일 경우, 검체의 검사부터 재시험한다.

< SBR 결과 판독기준 정리>

라. HPV 유전자 아형 결정

다음의 결과 분석표를 참조하여 HPV 유전자 아형을 결정한다.

① 아래의 그림과 같이 고위험군 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69과 저위험군 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44가 각 유전형에 대해서 2개의 스팟 씩 배열되어 있다.

② HBB 스팟은 각 L1 유전형을 알아보기 위해 다음의 그림에서 보는 바와 같이 배열되어 있다.

마. 표준 양성 물질의 판독 예.

1) 분류

*고위험군 : 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69

*저위험군 : 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44

2) 판독 예시

별첨 7. 키트 전체 구성의 보관조건 및 유효기간