디아키씨에이19-9 엘라이자(CA19-9ELISA) - 의약품 상세정보

1) 혈장 또는 혈청을 검체로 하며, 혈구나 혈액 응고 성분, 지방질이 많은 경우 원심하여 완전히 제거한다. 또한 심하게 용혈된 검체는 위양성을 보일 수 있으므로 사용하지 않는다.

2) 검체 내 보존제로 쓰이는 질화나트륨이 함유되어 있을 경우 위양성을 보일 수 있으므로 주의한다.

1) 모든 시약은 실험 시작 30분전 실온에 둔다.

2) 세척액의 조제

농축 세척액을 증류수 또는 이온 정제수로 20배 희석하여 필요한 양만 큼 준비한다.

예) 필요량이 1000ml일 경우 농축 세척액 50ml에 증류수나 이온 정제 수 950ml를 넣어 총 부피가 1000ml가 되도록 한 다음 잘 섞는다.

※ 농축 세척액은 냉장 보관 상태에서 결정이 생길 수도 있다. 이 경 우에는 37℃ ± 1℃ 항온 수조에서 녹인 다음 사용한다.

가. 검사 전 준비사항

1) 모든 시약은 실험 시작 30분 전에 실온에 둔 후 사용 전 가볍게 흔들 어 잘 섞은 후 사용한다.

2) 사용 후 남은 플레이트는 첨부된 비닐포에 방습제와 함께 잘 밀봉하 여 2～8℃에 보관한다.

3) 검체는 사용 전에 충분히 혼합한 다음 사용한다. 특히 동결되었던 검 체는 반드시 균질화시킨 후 사용한다.

나. 검사 방법

1) 시험에 필요한 양만큼 스트립을 꺼내어 스트립 홀더에 고정시킨다.

2) 준비된 플레이트 1A에 기질 Blank를 제외한 1B～2E well에는 표준 액을 각 농도별로 2well에 25ul, 2F～3A well에는 정도관리혈청 25ul 씩, 나머지 각 well에는 검체를 각각 25ul씩 차례로 분주한다.

3) 기질 Blank를 제외한 모든 well에 바이오틴 접합체액 100ul씩 넣고 스트립 홀더를 가볍게 쳐서 잘 혼합 후 밀봉 테이프로 밀봉하고 3 7℃(±1℃)에서 60분(±5분)동안 반응시킨다.

4) 반응 후 밀봉 테이프를 제거하고 각 well의 내용물을 흡입해내고 미 리 제조된 세척액으로 4회 세척한다.(각 well당 300ul 이상)

5) 세척이 완료된 플레이트를 흡습지에 뒤집어 적당히 쳐서 제거되지 아 니한 세척액을 완전히 제거한 다음, 접합체액을 기질 Blank를 제외한 모든 well에 100ul씩 넣고 스트립 홀더를 가볍게 쳐서 잘 혼합한 후 밀봉 테이프로 밀봉하고 37℃(±1℃)에서 30분(±5분)동안 반응시킨다.

6) 반응 후 밀봉 테이프를 제거하고 각 well의 내용물을 흡입해내고, 미 리 제조된 세척액으로 4회 세척한다. (각 well당 300ul 이상)

7) 세척이 완료되면 플레이트를 흡습지에 뒤집어 적당히 쳐서 제거되지 아니한 세척액을 완전히 제거한 다음, 기질액을 Blank를 포함한 모든 well에 100ul씩 넣고 스트립홀더를 가볍게 쳐서 잘 혼합한 후 실온 (15～30℃) 암소에서 20분(±1분)동안 반응시킨다.

8) 반응이 완료되면 반응 정지액을 모든 well에 100ul씩 분주하여, 흔들 어 주어 반응이 잘 일어나게 한다.

9) 플레이트 바닥을 부드러운 흡습지로 잘 닦아 습기를 제거하고 측정파 장 450nm, 참조파장(reference) 620nm에서 흡광도를 측정한다.

* 흡광도 측정은 반응 정지액을 분주한 후 30분 이내에 측정하여야 한 다.

[검사과정 요약]

1) 각 표준액과 검체에 대한 흡광도 값을 계산한다.

2) 표준 곡선 작성을 위하여 X축을 표준액 농도(ng/ml)로, Y축을 표준액 의 흡광도 값으로 하여 표준 곡선을 그린다.

3) 표준 곡선을 이용하여 검체의 흡광도 값을 대입하여 농도값을 산출한 다.

4) 검체의 농도 값이 37ng/ml보다 작으면 음성, 이상이면 양성으로 판정한 다.

5) 결과 계산의 예

※ 아래 값은 실험 결과의 예를 나타낸 단순한 실례이므로 실제 실험시 적용해서는 안 된다.

① 실험 결과

② 표준 곡선 그래프

1) 검체의 농도가 표준액의 최고 농도인 240ng/ml보다 높을 경우, 검체를 희석(10배, 50배, 100배)하여 검사를 수행하며, 희석된 검체인 경우 계 산된 농도값에 희석 배수를 곱하여 최종 농도를 결정한다.

2) 선별 검사에서 양성으로 판정된 경우 두 well을 반복 검사하여 하나 이 상 양성 반응을 보이면 최종 양성으로 판정한다.

항체를 효소에 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 비경쟁 면역 반응으 로, 항체에 결합되는 효소에 기질액을 넣어 색변화를 관찰하는 방법이다.

1) Streptavidin이 흡착된 플레이트에 Biotin이 결합된 항체와 검체인 항원 를 넣어준다.

2) 검체에 있는 CA19-9가 biotinylated 항체와의 결합을 통해 streptavidin 과 결합한다.

3) 결합하지 못한 항체와 항원은 제거한다.

4) 발색효소인 HRP가 결합된 2nd 항체를 결합시킨다.

5) 기질액을 넣어 효소와 결합시킨다.

6) 항원이 존재하면 푸른색을 띠게 된다.

7) 더 이상 발색이 안 되게 반응 정지액을 첨가하면 노란색을 띠게 된다.

8) 이것의 흡광도를 측정하여 CA19-9의 최종 농도를 측정한다.