안국바이오진단HPV지노타이핑칩키트 - 의약품 상세정보

(1) 검체의 준비

1) 진료담당의사가 자궁 경부에서 cytobrush를 이용하여 자궁경부 탈락세포를 취한다.

2) 각 병원 및 임상검사센터에서 공급하는 전용 용기(예: 1.5 ㎖ PCR 튜브나 15 ㎖ 코니칼 튜브에 PBS나생리식염수를 1 ㎖ 정도 넣어 공급하는 용기)에 넣어 밀봉한다.

3) 디엔에이를 추출하기 전까지 냉장 보관한다.

4) 검체 채취 후 가능한 빠른 시간 안에 디엔에이를 추출하여 시험을 실시한다.

(2) 시약의 준비 및 조제

1) 디엔에이 추출용 구성물 조제

가) 동결 건조된 25mg의 프로테이나제 케이를 1.25 ㎖ 멸균 증류수에 녹인 후 -20℃에 보관한다.

나) 농축액 상태의 디엔에이추출시약 2, 디엔에이추출시약 3은 사용 전 반드시 100% 에탄올을 넣고 잘 혼합한 후 사용한다.

[디엔에이추출시약 2은 100% EtOH 15 ㎖를 넣어 총 35 ㎖로 만든다.]

[디엔에이추출시약 3은 100% EtOH 40 ㎖를 넣어 총 50 ㎖로 만든다.]

[디엔에이추출시약 2, 디엔에이추출시약 3의 에탄올이 증발할 수 있으므로 뚜껑을 잘 닫아둔다.]

2) HPV 지노타이핑 칩 준비

가) 필요한 만큼의 프로브고정 슬라이드를 꺼낸 후 나머지 슬라이드는 밀봉하여 실온에서 보관한다.

나) 올리고 칩 슬라이드에 웰챔버 부착

[그림3]에서와 같이 제조된 올리고 칩 슬라이드의 로트번호 라벨이 붙어 있는 흰 부분과 투명한 부분의 경계선에 웰챔버의 세로 부분을 맞추고 웰챔버의 가로 부분을 슬라이드의 가로쪽 윗선에 맞추어 부착한다.

그림3. 올리고 칩 슬라이드에 웰챔버 부착 후 모양

3) HPV 지노타이핑 칩 반응 용액 조제

가) 교잡반응 완충액 I 은 실험시작 15 분전에 60 ± 1℃의 항온기에 넣어둔다.

나) 교잡반응 혼합완충액 조제

- 사용하기 15분전에 60℃에서 예열된 교잡반응 완충액 I과 교잡반응 완충액 II 을 18 : 1의 비율로 혼합하여 사용한다.

[ 실험 시 1 well당 교잡반응 완충액 I 90 ㎕에 교잡반응 완충액 II 5 ㎕를 혼합하여 조제한다.]

- 혼합된 완충액은 직사광선을 피하여 보관한다.

4) HPV 지노타이핑 PCR 마스터 프리믹스 조제

가) HPV PCR 효소을 제외한 각 구성물을 실험시작 30분 전에 실온에 꺼내어 녹인다.

나) HPV PCR 마스터 프리믹스 조제

사용하기 직전에 완전히 녹은 HPV PCR 프리믹스와 냉동 보관되어 있던 HPV PCR 효소를 30 : 1의 비율로 혼합하여 사용한다.

[실험 시 1 test 당 HPV PCR 프리믹스 15 ㎕에 HPV PCR 효소 0.5 ㎕를 혼합하여 조제한다.]

다) ß-globin PCR 마스터 프리믹스 조제

사용하기 직전에 완전히 녹은 ß-globin PCR 프리믹스와 냉동 보관되어 있던 HPV PCR 효소를 30 :1의 비율로 혼합하여 사용한다.

[실험 시 1 test 당 ß-globin PCR 프리믹스 15 ㎕에 HPV PCR 효소 0.5 ㎕를 혼합하여 조제한다.]

(1) 임상 검체로부터 디엔에이 추출

1) 프로테이나제 케이 20 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 미리 넣는다.

2) 채취한 샘플 중 400 ㎕를 튜브에 넣는다. 이때 만약 세포가 뭉쳐서 파이펫팅에 어려움이 있을 경우에는 셀롤로지컬 파이펫을 이용하여 옮긴다.

3) 200 ㎕의 디엔에이추출시약1을 넣고 5초 정도 가볍게 vortex하여 준다. 이때 샘플과 디엔에이추출시약1이 완전히 섞여야 lysis 효과를 최대한 얻을 수 있다.

4) 60℃에서 10분간 반응한다. 이때 세포가 뭉쳐서 파이펫팅에 어려움이 있을 경우에는 60℃에서 8시간(overnight) 반응한다.

5) 반응이 끝난 튜브에 100 ㎕의 이소프로판올 알코올을 넣고 5초 정도 가볍게 vortex하여 섞어준 다음 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 있는 용액을 떨어뜨린다.

6) 위 혼합물을 준비된 디엔에이바인딩컬럼 튜브에 넣는다. 이때 디엔에이바인딩컬럼 튜브의 뚜껑이 젖지 않도록 주의한다. 그 후 60초간 원심분리 한다. 만약 원심분리 후에도 혼합물이 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 빠져나가지 않고 남아있을 경우 다시 한 번 60초간 원심분리 하여 완전히 빠져나가도록 한다.

7) 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 통과한 여과액이 담긴 튜브는 버리고 다시 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 새로운 2 ㎖ 튜브에 장착한다.

8) 500 ㎕의 디엔에이추출시약 2를 튜브의 가장자리가 젖지 않도록 넣어주고, 60초간 원심분리 한다.

9) 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 통과한 여과액은 폐기용기에 버린 후 다시 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 장착한다.

10) 500 ㎕의 디엔에이추출시약 3을 튜브의 가장자리가 젖지 않도록 넣어주고, 60초간 원심분리 한다.

11) 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 통과한 여과액은 폐기용기에 버린 후 다시 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 장착한다.

12) 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 17,900 x g에서 2분간 원심분리 한다. 이 과정은 남아있는 에탄올을 완전히 제거하기 위한 단계로, PCR등의 효소반응을 위해 필수적인 단계이다. 만일 11)의 과정에서 여과액을 따라버리지 않고 진행할 경우 에탄올이 완전히 제거되지 않으므로 주의한다.

원심분리 후 에탄올이 디엔에이바인딩컬럼 튜브에 남아있을 경우, 17,900 x g에서 2분간 한 번 더 원심 분리하여 에탄올을 제거해준다.

13) 에탄올이 완전히 제거된 디엔에이바인딩컬럼 튜브를 제공된 1.5 ㎖ 튜브에 옮긴다.

14) 60℃로 가열된 100 ㎕의 디엔에이추출시약4를 디엔에이바인딩컬럼 튜브의 중앙이 충분히 젖도록 중앙에 넣는다. 이후 5분간 상온에 방치한다. 디엔에이추출시약 4, 대신 증류수를 사용할 경우 pH 7.0~pH 8.5 사이인지 확인해야 하며, 추출된 디엔에이의 보관 기간이 단축될 수 있으므로 주의하여야 한다.

15) 1분간 원심분리 하여 디엔에이 분리를 수행한다.

16) 추출한 디엔에이 5㎕를 0.7% 아가로즈겔에 전기영동하여 디엔에이가 있음을 확인한다. 전체적으로 인간 유전자의 크기가 10Kb~100Kb 까지의 큰 유전자로 전기영동표준물질을 이용할 수 없다.

17) 추출된 디엔에이는 바로 실험에 사용하거나 4℃ 에 보관하며, 장기간 보존을 위해서는 -20℃에 보관하도록 한다.

(2) PCR

- HPV 검체에 대해 PCR을 실시할 때에는 반드시 PCR 키트내에 구성물인 양성대조과 음성대조를 같이 실행한다.

1) HPV PCR 프리믹스 15 ㎕ 당 HPV PCR 효소 0.5 ㎕를 혼합하여 필요한 만큼의 HPV PCR 마스터 프리믹스를 제조한다. (표1 참조)

2) ß-globin PCR 프리믹스 15 ㎕ 당 HPV PCR 효소 0.5 ㎕를 혼합하여 필요한 만큼의 ß-globin PCR 마스터 프리믹스를 제조한다. (표1-1 참조)

3) HPV PCR 마스터 프리믹스 15.5 ㎕를 각각의 PCR 튜브에 분주하고 추출한 HPV 디엔에이 4.5 ㎕를 파이펫팅하여 잘 섞는다.

4) ß-globin PCR 마스터 프리믹스 15.5 ㎕를 각각의 PCR 튜브에 분주하고 추출한 HPV 디엔에이 4.5 ㎕를 파이펫팅하여 잘 섞는다.

5) 3)과 4)의 상층에 미네랄 오일을 한방울 정도 떨어뜨린 후 spin-down 하여 PCR 기기에 넣어 반응시킨다. (표2 참조)

6) PCR 기기는 PE9600(GeneAmp PCR9600, Perkin Elmer, 미국), MJ PCR machine (PTC-1160, MJ research, 미국), Biometra PCR machine (T-1 thermoblock, Biometra, 독일) 중의 한 개를 이용하였다.

(3) PCR 결과의 확인

1) HPV PCR 증폭산물 5 ㎕와 ß-globin PCR 증폭산물 5 ㎕를 각각 덜어 loading dye 2 ㎕와 섞는다.

2) 0.5X TBE 완충액 100ml 에 아가로스 2g을 용해시켜 2% 아가로즈 겔을 제조한 후, 150~200 volt에서 20~30분 동안 전기 영동한다.

3) UV transilluminator에서 150 bp의 HPV 증폭 산물과 340 bp의 β-globin 증폭산물 밴드를 확인한다. (이때 HPV 증폭산물인 450 bp의 밴드가 보일 경우도 있다.)

* 본 Kit는 HPV 유전자형을 구분하기 위하여 chip 반응 조건에 맞추어 제조되었으므로 PCR 증폭산물의 밴드가 약하더라도 HPV chip 결과에는 영향을 주지 않습니다.

4) β-globin 증폭산물이 확인된 검체의 잔여 PCR 증폭산물을 사용하여 HPV 지노타이핑 칩 사용설명서에 따라 칩 실험을 실시한다.

(4) 하이브리다이제이션 과정

1) HPV PCR 증폭산물 2.5 ㎕와 ß-globin PCR 증폭산물 2.5 ㎕를 섞는다.

2) 조제하여 놓은 교잡반응 혼합완충액 95 ㎕를 1)의 PCR 증폭산물에 첨가한 후, 파이펫팅하여 잘 혼합한다.

3) 웰챔버(5-웰, 체적은 100 ㎕)가 덮여져 있는 올리고 칩 슬라이드 상의 샘플주입구를 통하여 기포가 생기지 않도록 주의하면서 2)에서 준비한 PCR 증폭산물과 교잡반응혼합완충액 프리믹스를 웰챔버에 가득 채운다. (보통 95 ㎕ 정도면 된다.)

4) 하이브리다이제이션 챔버에 올리고 칩 슬라이드를 조심스럽게 올려놓고 습도유지를 위하여 덮개를 닫는다.

5) 60℃의 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 반응시킨다.

(5) 세척과정

1) 하이브리다이제이션이 끝난 올리고 칩 슬라이드의 웰챔버를 조심스럽게 떼어낸다.

2) 올리고 칩 슬라이드 1장당 약 20 ㎖의 증류수로 상온에서 5분간, 분당 50~100회의 속도로 흔들어 주면서 세척한다.

* 세척 시 올리고 칩 슬라이드의 표면이 잠길 정도의 양이 필요함

3) 올리고 칩 슬라이드를 공기 중에서 또는 스핀 드라이어를 이용하여, 올리고 칩 슬라이드 표면에 물기가 없도록 건조시킨다.

4) 건조된 슬라이드는 스캔을 실시하기 전까지 제공된 슬라이드 박스에 넣어서 실온상태에서 보관한다.

(6) 칩 스캔 및 분석

1) Axon Instruments사의 GenePix4000B 스캐너를 이용하여 532nm 파장에서 시그날을 확인한다. (Hardware setting : laser power 100, PMT 500)

2) 스캔한 디엔에이칩 영상으로부터 결과 판정을 위한 각 스팟의 시그날(intensity) 값을 분석한다.

3) 스팟의 시그날(intensity) 값 분석은 올리고 칩의 각 스팟 이미지 화소의 F532에서 Background532(B532)를 뺀 median값(시그날 Median Value (SMV) : F532Median - B532)을 사용한다.

4) HPV 유전형마다 2개 스팟의 SMV 값을 구한다.

5) 하이브리다이제이션 콘트롤 (HC)도 2개 스팟의 SMV 값을 구한다.

6) 총 34쌍 (HPV : 32개 x 2= 64개, HC: 1개x 2= 2개, NC: 1개x 2= 2개, 총 68개의 값)의 SMV 값을 가지고 아래와 같이 결과 판정을 한다.

7) 다음의 표에서와 같이 판정한다.

(본 검사에서 HPV 특이적인 150 bp 증폭이 된 경우임에도 하이브리다이제이션 콘트롤 프로브와 위치표식자에서만 1,000 이상의 SMV 값이 나올 경우, 32종 이외의 HPV형 감염으로 판정할 수 있다.)

8) 위치표식자 프로브는 HPV 형별 판독에는 영향을 주지 않으며, 다만 HPV 프로브 위치에 대한 기준 역할을 한다.

9) 하이브리다이제이션 콘트롤 프로브는 칩 시험 시 PCR 증폭산물과 프로브 사이에서 하이브리다이제이션이 정상적으로 수행되었는가에 대해 확인할 수 있는 판단(기준) 역할을 한다.

10) 분석 시 필요한 값

1. 탐촉자 하나의 좌측 표시

2. 탐촉자 하나의 우측 표시

(예시)

(7) 스캐너 사양 및 분석 조건

1) 스캐너 사양

2) 스캐너 분석 조건

(8) 결과 판정

그림 1. 결과 판정 흐름도

1) 6. 정도관리사항을 만족하는 경우 아래에 따라 판정한다.

2) 음성일 경우 : 가) 와 나) 두 항목의 조건이 만족할시에 음성으로 판정한다.

가) 하이브리다이제이션 콘트롤(HC)의 SMV 값이 모두 1,000이상이고, PCR에서 인터날 콘트롤(β-globin) 밴드 340 bp만 증폭되고, HPV에 특이적인 150bp의 밴드가 증폭되지 않은 경우 음성으로 판정할 수 있다.

나) 32가지 HPV 유전자형 각각의 SMV 값이 1,000 미만일 경우, 바이오코아 키트에서 검출 가능한 32가지 HPV에 대하여 음성으로 판정 할 수 있다.

3) 양성일 경우 : 가) 와 나) 두 항목의 조건이 만족할시에 양성으로 판정한다.

가) 올리고 칩 슬라이드에서 하이브리다이제이션 콘트롤(HC)의 SMV 값이 모두 1,000이상 이고, PCR에서 인터날 콘트롤 (β-globin) 밴드 340 bp 및 HPV 특이적인 150 bp의 밴드가 증폭되어야 한다.

나) 각 HPV 유전자형의 SMV 값이 1,000이상일 경우, 해당 유전형의 HPV 감염을 양성 판정할 수 있다. (같은 HPV 유전자형 2개 스팟의 SMV 값이 모두 1,000이상이어야 한다.)

다) HPV PCR 프리믹스 결과에서 340 bp의 인터날 콘트롤(β-globin) 밴드 와 150 bp의 HPV 특이적인 밴드가 증폭되었으나, 올리고 칩 슬라이드 시험 결과 32개 HPV 유전자형 프로브의 SMV값이 모두 1,000 미만일 경우 바이오코아 키트에서 검출 가능한 32가지 HPV 유전자형 이외의 다른 유전자형으로 판정할 수 있다.

4) 판정 불가

가) 하이브리다이제이션 콘트롤(HC)의 SMV 값 중 1개라도 1,000미만일 경우 결과 판정이 불가능하므로 재시험을 실시한다.

나) 같은 HPV 유전자형의 2개 스팟의 SMV 값 중 1,000이상과 미만의 결과가 동시에 나올 경우 결과 판정이 불가능하므로 재시험 한다.

다) 인터날 콘트롤로 사용된 340 bp의 β-globin 유전자가 PCR을 통하여 증폭되지 않았을 경우 재시험을 실시한다.

라) HPV에 특이적인 150 bp의 밴드가 증폭되지 않고, 하이브리다이제이션 콘트롤과 HPV 특이타입의 SMV 값이 모두 1,000이상으로 나타난 경우 재시험을 실시한다.

표 3. HPV 지노타이핑 칩 키트 결과 판정 요약 표

(1) HPV chip 검사 시에는 정도관리를 위하여 양성대조와 음성대조를 대상으로 검사를 실시해야 한다.

(2) 양성 대조는 HPV 16 유전자형으로 chip상에서 HPV 16 유전자 특이 프로브, 하이브리다이제이션 콘트롤 프로브와 위치 표식자 프로브에서 SMV값이 1,000 이상으로 나타나야 하며, 나머지 다른 HPV 유전자형 특이 프로브에서는 SMV값이 1,000 미만으로 나타나야 된다.

(3) 음성 대조는 HPV 음성으로 chip상에서 하이브리다이제이션 콘트롤 프로브와 위치 표식자 프로브의 SMV값이 1,000 이상으로 나타나야 하며, HPV 32개 유전자형 특이 프로브에서는 SMV값이 1,000 미만으로 나타나야 된다.

(4) HPV Chip 시험 시 음성콘트롤 프로브는 양성, 음성 대조 및 모든 검체에서 SMV 값이 1,000 미만으로 나타나야 한다.

(5) HPV Chip상에서 하이브리다이제이션 콘트롤 프로브와 위치표식자 프로브의 SMV 값이 1,000 미만으로 나타날 경우에는 재시험을 실시하여 PCR 증폭여부 및 시험과정 중 오류를 확인한다. 재시험 결과가 동일한 경우 유통등의 문제가 있는 것으로 판단되므로 해당제품을 폐기하고 새로운 제품으로 시험을 실시한다.

(1) 스캐닝 결과 스팟이 나타나지 않을 경우

1) 검체에서 추출된 게놈 디엔에이를 전기영동하여, 디엔에이 추출여부를 확인한다.

2) 아가로즈겔상에서 게놈 디엔에이가 확인되었으나, HC 프로브와 반응하는 β-globin PCR 증폭산물이 확인되지 않을 경우에는 PCR 증폭과정중의 오류로 판단 될 수 있다. 이 과정은 β-globin PCR 증폭여부로 DNA 추출과정을 확인하는 단계이다.

3) 위치표식자 및 하이브리다이제이션 콘트롤 스팟이 나타나지 않은 경우에는 교잡반응 단계의 오류 가능성이 있으므로, 교잡반응완충액 I 및 교잡반응완충액 II의 첨가여부를 확인한다. .

4) 하이브리다이제이션 콘트롤 스팟만 확인되고 위치표식자가 나타나지 않은 경우에는 시험 과정중 혼합물(Mixture) 제조과정에서 PCR 증폭산물이 첨가되지 않은 것이므로 PCR 증폭산물의 첨가여부를 확인한다.

5) 위치표식자와 하이브리다이제이션 콘트롤 스팟은 정상적으로 확인되었으나 HPV 유전자형의 스팟이 나타나지 않은 경우에는 검체가 HPV에 감염되지 않았거나 또는 본 Kit에서 진단 할 수 없는 유전자형의 HPV 감염일 가능성이 있으므로 다른 방법으로 확인하여야 한다.

(2) 스캐닝 결과 여러 개의 HPV 특이 스팟이 나타나는 경우

1) 여러 개의 HPV 특이 스팟이 동시에 나타나는 경우에는 시험과정에서 다른 검체와의 오염 및 다중 감염등의 경우이다. 이러한 경우 재시험을 수행하여 동일한 결과일때 다중감염을 고려할 수 있으나 다른 방법으로 확인하여야 한다

(3) 스캐닝 결과 back-ground의 높은 시그날로 인하여 결과 판정이 불가능한 경우

1) 올리고 칩 슬라이드에 나타나는 back-ground는 대부분 하이브리다이제이션 과정에서 올리고 칩 슬라이드에 남아 있는 솔트성분(NaCl)에 의한 영향이므로 하이브리다이제이션 후 세척과정(post washing)을 강화하도록 한다. (예 : 40 rpm → 60rpm)

2) 올리고 칩 슬라이드의 세척 후 슬라이드에 남아있던 용액이 표면에 말라서 배경이 얼룩처럼 나타날 수 있으므로 원심분리 등으로 건조과정이 빠르게 진행하도록 한다.

3) 스팟의 back-ground 부분에 이물질과 같은 형광 intensity가 나타날 경우 정확한 스팟의 intensity를 얻어낼 수 없다. 따라서 재시험을 통하여 검사의 정확도를 높여야 한다. 올리고 칩 슬라이드 취급시에는 항상 일회용 장갑을 착용하고 이 물질등이 오염되지 않게 한다.

4) 슬라이드 위의 웰챔버 내에 충분한 양의 sample을 채워 넣지 않을 경우 sample의 건조로 인하여 back-ground가 발생될 수 있으므로 충분한 양의 sample을 채워 넣도록 한다.

5) 하이브리다이제이션 과정에서 충분한 습도가 유지 되지 않을 경우 sample의 건조로 인하여 back-ground가 발생될 수 있으므로 충분한 습도를 유지시키도록 한다.

6) 스팟의 모양이 정상적인 원형 형태가 아닌 경우(예: 반원 형태)에는 올리고 칩 슬라이드 처리 과정의 부주의로 인한 긁힘 현상이 나타날 수 있다. 취급시 부주의로 인하여 정상적인 스팟의 모양이 아닐 경우 재시험을 통하여 정확도를 높여야 한다.

(4) 교차반응이 의심되는 경우 (SMV 값 1,000 미만)

자사의 임상시험 결과 SMV값이 1,000 미만이나, 특이 스팟이 육안으로 확인되는 결과를 얻었다. 문헌에는 보고되지 않았지만, HPV 26 type 샘플에서 HPV 32 type 프로브와 HPV 16/18 다중감염 샘플에서 HPV 31 Type 프로브와 교차반응이 나타날 가능성 있는 것으로 판단된다. 보다 정확한 결과를 확인하고자 할 경우 재시험 또는 다른 방법을 사용하여 시험결과를 확인해 볼 것을 권장한다.