에스디 바이오라인 티비 엔에이티 (SD BIOLINE TB NAT) (수출용)(수출명: 별첨) - 의약품 상세정보

① 특정 핵산과 신호 프로브의 등온 동시 증폭

등온 조건에서 플루오세린 (fluoresein)과 바이오틴 (biotin)이 결합된 프로브 (probe)로 핵산의 증폭이 일어난다. 고온에서 두 쌍의 프라이머 (primer)와 타깃 DNA가 해리된다. 두 쌍의 프라이머 중에서 안쪽 프라이머는 DNA-RNA-DNA로 이루어진 키메라 프라이머 (chimeric primer)이다. 키메라 프라이머의 3'쪽은 타킷 DNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖지만 5'의 DNA-RNA 부분은 상보적이지 않다. 바깥쪽 프라이머의 염기서열은 타깃 DNA의 염기서열과 상보적인 특징을 갖는다. 안쪽 프라이머는 바깥족 프라이머의 아래 부위에 결합하고 DNA 중합효소에 의해서 동시에 중합된다. 바깥쪽 프라이머는 안쪽 프라이머로 생산된 중합체를 대체하기도 하여 안쪽 프라이머로 중합된 것과 함께 두 종류의 중합체 산물을 생성한다. 1차로 중합된 산물은 다시 주형으로 사용되어 안쪽, 바깥쪽 프라이머들로 인해 2차, 3차 등의 중합체를 지속적으로 생성한다. 또한 안쪽 프라이머로 중합된 중합체는 DNA-RNA 혼성화된 부분을 가지고 있고 RNA 분해효소 H가 DNA-RNA 혼성물의 RNA 부분을 분해하여 DNA 중합효소로 중합할 수 있는 환경을 제공한다. 이러한 과정에서 타깃 DNA는 기하급수적으로 증가하게 된다. 타깃 DNA를 증폭하는 과정에서 DNA-RNA-DNA로 구성된 키메라 프로브는 증폭된 DNA에 혼성화되고 RNA 분해효소 H는 혼성물의 DNA-RNA 구조를 분해하여 플로레세인 부분과 바이오틴 부분으로 나눈다.

② 면역 크로마토그리피법

나이트로 셀룰로스 멤브레인을 solid phase로 하여 검사선 위치에 플루오레세인 단클론 항체 (anti-fluoresein)를 흡착시킨 검사용 디바이스에 검사하고자 하는 샘플을 검체 점적 부위 (S)에 떨어뜨리면 검체 중에 프로브가 존재할 경우, 1차적으로 골드에 접합되어 있는 스트렙토아비딘과 반응하여 면역크로마토그래피 (immunochromatography) 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하면서 검사선 위치에 흡착되어 있는 플루오레세인 단클론 항체와 2차적으로 반응하게 되다. 이때 결핵 음성일 경우, 검사선 위치에서 보라색으로 발색하게 된다.

1) 검체

① 사람의 객담, 기관지 세척액, 농즙, 뇌척수액, 소변, 생체조직 등

② DNA 추출물

2) 검체의 준비 방법

(1) 객담

가. 4% NaOH로 처리한 후, 원심 분리하여 상층을 제거하고 침전물을 사용한다.

(2) 각종 체액

가. 원심 분리하여 침전물을 생리식염수나 인산염 완충액으로 녹여 냉장에 보관하며 사용한다.

3) 버퍼 준비

(1) 40% NaOH 용액을 멸균 3차 증류수로 10배 희석하여 사용한다.

1) 핵산의 추출

① 객담이 담겨있는 50 ml tube 에 4% NaOH 용액을 객담과 동량으로 첨가하여 끈끈한 객담을 풀어준다. 객담이 잘 풀리도록 NaOH를 넣어줄 때, tip 으로 저어주고 pipette으로 1.5 ml tube에 1 ml 씩 두 군데에 나누어 담아 원심분리 (13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거한다. Pellet은 tapping하여 clump를 완전히 풀어준다.

② Pellet에 resuspension 버퍼 용액 500 ul을 각각 첨가한다. 10초간 vortex하고 spin down한다.

③ 두 개의 튜브를 하나로 합친 후, 원심분리 (13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 버린다.

④ Pellet에 멸균수 1 ml 을 첨가하여 혼합하고 원심분리 (13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 버린다.

⑤ 상기 ④ 과정을 반복한다.

⑥ Pellet에 extraction buffer 60 ul를 첨가하고 10초간 vortex한다. (사용전 잘 섞어 사용한다.)

⑦ 56℃에 20분간 방치한 후 (2 ~ 3분 간격으로 10초간 vortex 혹은 tapping) 100℃에 8분간 방치한다.

⑧ 20 초간 vortex 후, 원심분리 (13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 취해 (침전물이 딸려오지 않게 조심스럽게 취한다. 층 분리가 잘 되지 않았거나 부득이하게 딸려왔을 경우 원심분리를 한번 더 실시한다.) template DNA로 사용한다. (다음 단계의 실험을 할 수 없다면 이 단계에서 멈추고 냉동 보관한다)

2) 핵산 및 신호 프로브의 증폭

① 1.5 ml 튜브에 상기 ⑧ 의 상층액 10 ul를 넣고 amplification mixure 4 ul, primer mixture 3 ul 를 첨가하여 혼합 한 후 , 95^oC에서 5분간 열처리한 후, 항온수조를 이용하여 60℃에 5분간 정치하여 온도를 낮춘다. (음성대조군은 상층액 대신 negative control 10 ul를 사용하여 아래 과정을 동일하게 수행한다.)

② 상기 ① 과정을 하는 동안 새로운 1.5 ml tube 에 enzyme mixture 2 ul와 probe mixture 1 ul 를 혼합한 후 얼음위에서 보관한다.

③ 상기 ① 의 튜브에 상기 ② 의 혼합액 3 ul를 첨가한 후, 신속하게 spin down (6,000 rpm, 2초) 한다.

④ 상기 ③ 의 tube를 항온수조 60^oC에서 90분간 반응시킨 후, 얼음 위에서 5분간 냉각한다.

3) 결과 판독 및 판정

상기 ④ 의 튜브에 running buffer 60 ul를 첨가하여 잘 혼합한 후, 전량을 래피드 카세트 흡입구에 loading한 후, 20 ~ 30분간 실온에 방치한 후 결과를 판독한다.

모든 검사 결과는 대조선(C)에 보라색 선이 나타나야 한다. 대조선 (C)에 밴드가 나나타지 않으면 검사가 잘못되었거나 시약의 품질에 문제가 있을 가능성이 있으므로 이 검사는 무효화시키고, 새로운 시약으로 재시험한다.

(1) 음성 : 대조선 (C)와 검사선 (T) 위치에 밴드가 나타나는 경우, 음성으로 판정한다.

(2) 양성 : 대조선 (C)의 위치에만 밴드가 나타나거나 검사선 (T) 위치의 밴드가 대조군 샘플에서의 검사선 (T) 위치의 밴드 세기 보다 약하게 나타나는 경우, 양성으로 판정한다.

(3) 재시험 : 어떠한 밴드도 나타나지 않는 경우 혹은 검사선에만 밴드가 나온 경우에는 무효이므로 새로운 디바이스를 사용하여 재시험한다.

ㄱ. 대조선에 밴드가 나타나지 않으면 검사가 잘못된 경우 또는 시약의 품질에 문제가 있을 가능성이 있으므로 이 검사는 무효화시키고, 새로운 시약으로 재시험 한다.

ㄴ. 재시험의 경우는 검체량 부족 등의 조작상의 미숙일 수 있다.