에스디 일본뇌염 바이러스 아이지엠 캡쳐 엘리자 (SD JEV IgM Capture ELISA)(수출용) - 의약품 상세정보

1) 검체의 준비 및 보관, 재사용

[검체의 준비] : 검체의 희석

음성대조액, 양성대조액 및 검사하고자 하는 시료를 희석하기 위하여 테스트 튜브 또는 마이크로 튜브를 준비하고 검체 희석액으로 100배 희석한다. (예 : 혈청검체 10㎕ 와 검체 희석액 990㎕ 을 넣고 잘 섞어준다.)

[검체의 보관, 재사용]

(1) 혈청만 검체로 사용할 수 있다.

(2) 정맥 천자로 채혈한 혈액을 항응고제가 들어 있지 않은 튜브에 수집한다.

(3) 실온에 약 30분간 방치해 응고가 일어나도록 한 후 원심분리에 의해 상청의 혈청을 분리시킨다.

(4) 용혈이 심하거나 미생물에 오염된 검체의 경우는 부정확한 결과를 나타낼 수 있으므로 주의한다.

(5) 분리된 혈청은 2 ~ 8℃에서 보관 시 3일간, -20℃ 이하에서 냉동 보관 시 1년간 사용 가능하다.

(6) 검체는 사용 전에 충분히 혼합한다. 특히 동결되었던 시료는 반드시 혼합기를 이용하여 균질화 시킨 후 사용한다.

2) 시약의 준비 및 보관

[시액의 조제]

1) 일본뇌염 바이러스 항원액 조제

1 병의 일본뇌염 바이러스 항원분말을 효소표지항체 희석액 1.5 ml 로 녹인다.

2) 효소표지항체액 준비

효소표지항체액은 항체 흡착 플레이트에 검체를 분주하기 직전에 준비하여 효소표지항체액의 반응 1시간과 항체흡착 플레이트에 분주된 검체의 항온 1시간이 동시에 진행되도록 한다.

농축 효소표지항체액 (2배 농축액)과 위 1)에서 제조한 일본뇌염 바이러스 항원액을 사용하고자 하는 well 수에 따라 필요한 양만큼 1 : 1 로 혼합한다. (예 : 농축 효소표지항체액 (2배 농축액) 1.5 ml 과 일본뇌염 바이러스 항원액 1.5 ml 을 혼합하여 3 ml의 효소표지항체액을 조제하면 약 30 테스트 분량의 효소표지항체액이 된다.)

3) 세척액의 준비

농축 세척액 (20배 농축액)을 정제수 (탈이온수나 증류수) 로 20배 희석한다. 세척액은 한 well 당 약 350㎕가 소요된다. (예 : 증류수 450ml에 농축세척액 50ml을 첨가하여 세척액을 조제한다.)

4) 기질용액의 준비

기질용액을 사용하고자 하는 well 수에 따라 기질액 A와 기질액 B를 1:1의 비율로 잘 섞은 후 기질반응에 사용한다. (예 : 기질액 A 5ml과 기질액 B 5ml을 잘 섞어 기질용액을 조제한다.)

[조제한 시액의 보관조건 및 사용기간]

* 조제 후 바로 사용하지 않는 경우, 2 ~ 8℃에서 냉장보관 해야한다. 냉장 보관 시, 조제 후 1일

이내에 사용이 가능하다.

[개봉한 시약의 보관조건 및 사용기간]

3) 키트의 보관

(1) 키트는 2 ~ 8℃에서 냉장 보관한다.

(2) 키트는 밀봉된 상태에서 패키지 또는 각 시약의 라벨에 인쇄된 사용기간까지 안정하 다.

[검사방법 요약표]

[검사방법]

1) 검사에 필요한 well 수를 결정(음성 대조액 3 wells, 양성 대조액 2 wells 및 검사하고자 하는 시료) 하고 사용하고 남은 well 은 자체 은박포에 실리카겔과 함께 밀봉하여 2 ~ 8℃에 보관한다.

2) 음·양성 대조액 및 검사하고자 하는 시료를 검체 희석액으로 100배 희석하여 준비한다.

3) 1병의 일본뇌염 바이러스 항원 분말을 효소표지항체 희석액 1.5 ml로 녹여 일본뇌염 바이러스 항원액을 준비한다.

4) 효소표지항체액의 제조를 위해 농축 효소표지항체액 (2배 농축액)과 상기 3)에서 제조한 일본뇌염 바이러스 항원액을 1 : 1 로 혼합한 후 실온 (15~30℃)에서 1시간 동안 반응시킨다.

5) 상기 2)에서 100배로 희석한 음성 대조액 (3 wells), 양성 대조액 (2 wells) 및 검사하고자 하는 시료를 항체가 코팅된 플레이트 각 well에 100㎕씩 분주하고 잘 혼합한다.

6) 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하여 37±1℃ 항온기에서 1시간 반응시킨다.

7) 세척액을 ‘시액의 조제’항에 따라 조제한다.

8) 반응 후 각 well의 내용물을 흡입하고 세척액으로 다음과 같은 방법으로 5회 세척한다. 우선 well 내의 내용물을 흡입장치로 제거한 후, 세척액을 well에 완전히 채우고 (well당 약 350㎕씩) 약 10초 정도 방치한 후, 용액을 흡입하는 방법으로 5회 반복한 다음, well 내에 남아있을 수 있는 잔여 용액을 완전히 제거한다.

8-1) 세척 과정

가. 자동 세척

(1) 자동 세척기를 이용하여 5회 세척한다.

(2) 5회의 세척 과정이 끝나면, 플레이트를 뒤집어 흡습타월에 대고 털어서, 완전히 세척액이 제거될 수 있도록 한다 .

나. 수동 세척

(1) 적당한 용기를 사용하여 각 well의 잔여 용액을 완전히 제거한다.

(2) 각 well에 희석된 세척액 350 ㎕씩 분주한다. 이 때, 세척액에 거품이 생기지 않도 록 주의한다. 분주 후 즉시 세척액을 제거한다.

(3) 위 (2)번 과정을 4번 더 반복하여, 총 5회 세척한다.

(4)마지막 세척 과정이 끝난 후, 플레이트를 뒤집어 흡습지에 대고 털어서, 완전히 세 척액이 제거될 수 있도록 한다 .

9) 세척이 끝난 플레이트에 1시간 전에 조제하여 실온에서 항온시킨 효소표지항체액을 항체흡착 플레이트 각 well에 100㎕씩 분주하고 잘 혼합한 후 첨부된 밀봉테이프로 밀봉한다.

10) 37±1℃ 항온기에서 1시간 반응시킨다.

11) 반응 후 각 well의 내용물을 흡입하고 세척액으로 다음과 같은 방법으로 5회 세척한다. 우선 well 내의 내용물을 흡입장치로 제거한 후, 세척액을 well에 완전히 채우고 (well당 약 350㎕씩) 약 10초 정도 방치한 후, 용액을 흡입하는 방법으로 5회 반복한 다음, well 내에 남아있을 수 있는 잔여 용액을 완전히 제거한다.

12) 기질용액을‘시액의 조제’항에 따라 조제한다.

13) 조제한 기질용액을 모든 well에 100㎕씩 분주한 후, 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하고, 실온(15~30℃) 에서 10분 동안 반응시킨다.

*주의) 기질액 A, B용액의 혼합 과정 중에 작은 결정이 생기면, 다시 한 번 잘 섞어준다.

14) 반응 정지액을 모든 well 에 각 well 당 100㎕씩 넣고 잘 혼합하여 청색이 노란색으로 완전히 변하도록 한다.

15) 공기를 맹검으로 하여(Air blank) 음성 대조액, 양성 대조액 그리고 각 시료의 흡광도를 측정한다. 이때 흡광도의 측정 파장은 450 nm로 하고, 이중파장흡광도측정기 (dual wavelength reader) 를 사용할 경우 참조파장은 620 nm로 하며 반응 정지액을 넣고 30분 이내에 흡광도 값을 측정 한다.

(1) 정도관리

가. 음성 대조액의 흡광도 값은 -0.005 이상 0.150 이하이어야 하며, 만약 1개의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 나머지 2개 값의 평균값으로 산출한다. 만약 2개 이상의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 재실험을 하여야 한다.

나. 양성 대조액의 흡광도 값은 1.000 이상이어야 한다. 양성 표준액의 평균 흡광도 값이 위 범위를 벗어난 경우에는 검사과정이나 시약에 문제가 있는 것이므로 그 원인을 확인한 후 재검사 하여야 한다.

(2) 판정 기준값 (Cut-off) 계산 및 판정

가. 음성 대조액 평균값 계산 : 상기 검사방법에 따라 음성 대조액의 흡광도를 얻은 다음 그 세 값의 평균값을 산출한다.

예)

*음성 대조액의 평균 흡광도 : NCx = 0.143/3 = 0.047

나. 양성 대조액 평균값 계산 : 상기 검사방법에 따라 양성 대조액의 흡광도를 얻은 다음 그 두 값의 평균값을 산출한다.

예)

*양성 대조액의 평균 흡광도 : PCx = 4.338/2 = 2.169

다. 판정 기준값 (Cut-off) 계산

음성 대조액 평균흡광도(NCx)값에 0.100을 더하여 판정 기준값을 구한다.

예) NCx + 0.100 = 0.047 + 0.100 = 0.147

(3)결과의 판정

가) 음성 : 판정 기준값 미만의 흡광도값을 나타내는 검체는 음성으로 판정한다.

검체 내에 검출 가능한 일본뇌염 바이러스 특이적인 IgM 항체가 없음을 의미 하나, 감염이 의심되는 환자의 경우, 7~14일 후 재검사 한다.

나) 양성 : 판정 기준값 이상의 흡광도값을 나타내는 검체는 양성으로 판정한다.

검체 내에 검출 가능한 일본뇌염 바이러스 특이적인 IgM 항체가 존재함을 의 미하나, 확실한 결과 판정을 위해 추가적인 진단이 필요하다.

(1) 시험 방법, 주의 사항, 결과 판정을 반드시 숙지한 후, 실험을 진행하여야 한다.

(2) 실험은 임상적 징후나 감염 환경에 노출된 환자를 대상으로 수행되어야 한다.

(3) 검체 관련 주의사항

1) 저온 살균된 시료(60℃에서 10 시간 이상)는 반응성이 저하될 수 있으므로 사용하지 않는다

2) 용혈이 심하거나 미생물에 오염된 검체의 경우는 부정확한 결과를 나타낼 수 있으므로 원심분리 후, 검사를 수행한다.

3) 시료에 포함된 지방성 물질이나 황달 치료제는 시험 결과에 영향을 미칠 수 있다.

4) 시료에 포함된 류머티즘인자는 검체에 포함된 물질과 반응을 일으켜 시험 결과에 영향을 미칠 수 있다.

(4) 전형적인 Flavivirus group (Dengue virus, Murray Valley encephalitis, Yellow fever, West Nile virus)에 속하는 바이러스는 교차 반응을 유발할 수 있다.

(5) 이종 친화성 항체는 교차반응을 유발하여, 위양성 반응을 나타낼 수 있다.

(6) 실험 중 검체가 제대로 들어가지 않으면 음성 결과를 나타낼 수 있으므로, 임상적으로 양성이 의심되는 검체가 음성 결과를 나타낸 경우 재시험 해야 한다.