칼레스타드자가항체검사 - 의약품 상세정보

1) 검체로는 혈청을 사용한다.

2) 매우 용혈되었거나 지성인 혈청은 기질의 배경염색이 증강될 수 있다.

3) 일반적인 주의사항을 준수하여 정맥천자하여 혈액을 채취한다.

4) 혈청 검체는 증발 및 오염으로부터 보호하여 저장하면 2~8℃에서 3일간 안정하다.

5) 장기간 보존할 때는 -20℃이하에서 동결하여야 한다.

6) 검체의 동결/용해의 반복을 피한다.

1) 필요한 수의 슬라이드를 냉장고로부터 꺼낸다. 호일백을 열지 않고 실온화 되도록 한다 (20분간). 모든 시약이 실온화되도록 한다.

2) 초순수로 PBS를 재조제한다. PBS를 담는 용기는 청결하고 오염이 없어야 한다. 세척하지 않은 PBS 용기는 다시 사용하지 않아야 한다.

3) PBS로 테스트 할 혈청의 스크리닝 희석액을 만든다. PBS 또는 환자 검체 희석액을 이용하여 희석할 수 있다. 거꾸로 뒤집어 섞는다.

4) 만일 분석 민감도를 보기위하여 양성대조액을 사용하였다면 혈청 제조에 사용한 희석액으로 양성대조액의 2배계단희석액(serial doubling dilution)을 조제한다. 1:2 희석부터 시작하여 최소한 QC Report에 명시되어 있는 endpoint보다 한 번 이상의 것까지 계속한다.

5) 슬라이드를 호일백으로부터 항습기(humidity chamber)로 옮긴 후, 즉시 대조 액과 희석된 혈청을 25-35㎕씩 웰에 가한다. 검체가 웰을 완전히 덮도록 한다. 이 단계를 모든 슬라이드에 대해서 반복한다.

6) 항습기/슬라이드홀더를 덮고 실온에서 20분간 방치한다. (주의 : 배양기가 움직이지 않도록 한다.)

7) PBS로 슬라이드를 간단히 세척한다. PBS가 각 웰 위를 세척하도록 웰 위에 흘려보낸다. 이때 PBS를 웰에 직접 가하지 않는다.

8) PBS로 채워진 염색용 접시에서 10분간 슬라이드를 세척한다. 세척하는 동안염색 접시를 부드럽게 몇 번 교반하거나 magnetic stirrer를 사용한다.

9) 각 슬라이드 혹은 슬라이드 홀더를 염색접시에서 꺼내고 blotting strip을 이용하여 웰 주위의 과도한 PBS를 흡수한다. 스트립이 기질에 직접 닿지않도록 한다.

10) 슬라이드를 항습기(humidity chamber)에 놓고 즉시 대략 25㎕의 FITC 콘쥬게이트를 각 웰에 가한다. 이 스텝을 모든 슬라이드에 대해 반복한다.

11) 항습기/슬라이드 홀더를 실온에서 20분간 방치한다.

12) PBS를 흘려 슬라이드를 가볍게 헹군다. PBS가 각 웰 위를 세척하도록 웰 위에 흘려보낸다. 이때 PBS를 웰에 직접 가하지 않는다.

13) 슬라이드를 PBS로 채운 염색 접시 안에서 10분간 세척한다. 또는 대조염색을 실시한다(선택과정임). : Evans’ Blue 대조염색액을 염색접시 안 PBS에 넣고(2-5방울/PBS 150mL) 슬라이드를 10분간 세척한다.

14) 각 슬라이드 혹은 슬라이드 홀더를 PBS에서 꺼내고 종이 타월 위에서 간단히 액체를 버린다. 슬라이드 홀더를 사용하였다면 슬라이드를 떼어낸다. 슬라이드마다 봉입제 4±1방울을 가하고 커버슬맆을 덮는다.

15) 어두운 곳에서 형광현미경으로 슬라이드를 관찰한다. 각 기질 웰에 대하여 자가항체의 존재와 부재를 검사한다. 봉입제는 반영구적이므로 슬라이드가 어두운 곳에서 4℃에 보관되었다면 1-2주 후에 다시 확인할 수 있다. 드라이 또는 오일 렌즈를 사용하고 전체 배율을 400X 또는 550X로 한다. 기질 식별을 용이하게 하기 위해 먼저 양성 대조액을 관찰한다. weak positive 반응을 확인하는 데는 1000X 배율을 권장한다.

16) 다음의 기준을 사용하여 강도의 등급을 매기고 기록한다.

ㆍ +4 빛나는 사과빛 녹색의 형광

ㆍ +3 밝은 사과빛 녹색의 형광

ㆍ +2 분명하게 구분되는 양성 형광

ㆍ +1 염색이 배경 형광에서 분명하게 구분되도록 하는 가장낮은 특이적 형광

1) 양성 및 음성 대조액이 모두 각 분석 시마다 포함되어야 한다.

2) 양성대조액은 양성으로 염색된 운동핵을 보여야 한다. 운동핵은 Crithidia luciliae의 편모를 향한다. 양성으로 염색된 운동핵은 고른 형광의 디스크 또는 가장자리가 중앙보다 더 진하게 염색된 도넛 형태로 나타난다. 핵은 운동핵보다 더 크며 형광을 나타낼 수 있지만, 항 nDNA 항체에 특이적이지 않다. 분석의 민감도를 관찰하기 위해서, 염색은 QC Report에 제시된 Control 역가의 1(+ 혹은 -) dilution 내에서 +1이어야 한다. Control 역가는 현재 제조되는Bio-Rad Laboratories FITC Conjugate를 사용하여 세 롯트 이상의 Bio-Rad Laboratories substrate slides로 결정된다. 실제 실험실에서 나타나는 control 역가는 기술, 해석, 혹은 현미경 차이로 인하여 플러스 혹은 마이너스 1 doubling dilution 이내에서 달라질 수 있다. 만일 결과가 2 혹은 그 이상의 doubling dilution으로 다양한 경우 한국바이오래드㈜에 문의한다.

3) 음성대조액은 운동핵에 형광 염색이 없어야 한다.

1) 각 영역에서 잘 관찰되는 유기체 1개만을 검정한다. 모든 유기체가 최적으로 관찰되지는 않을 것이다. 이것은 슬라이드상에서의 방향, 개체별 성장 상태, 현미경 검경상의 장해 등의 이유 때문이다.

2) 운동핵은 Crithidia luciliae의 편모를 향하게 된다. 운동핵의 양성 염색은 고른 형광의 디스크 또는 가장자리가 중앙보다 더 진하게 염색된 도넛 형태로 나타난다. 핵은 운동핵보다 더 크며 형광을 나타낼 수 있지만, 항 nDNA 항체에 특이적이지 않다. 핵은 형광을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있지만, 핵 형광을 항-nDNA 검사 판정 기준으로 이용하지 않는다.

3) 아래 다섯가지 형태의 염색 결과가 나타날 수 있다.

4) 만일 검체가 스크리닝 희석 시에 양성이면, 검체를 계대 희석하고 이를 가지고 다시 테스트하여 그 역가를 측정한다. 자가항체의 역가는 15번 단계에서의 배율에서 기질에 대하여 +1의 특이 형광을 보이는 가장 높은 희석도이다.

5) 만일 Evan’s Blue 대조염색을 사용하면, 세포는 적색-오렌지색으로 나타날 것이며 특이적인 형광의 존재 여부를 관찰하여야 한다.