칼레스타드항핵항체검사에이취이피2세포 - 의약품 상세정보

1) 검체로는 혈청을 사용한다.

2) 매우 용혈되었거나 지성인 혈청은 기질의 배경염색이 증강될 수 있다.

3) 일반적인 주의사항을 준수하여 정맥천자하여 혈액을 채취한다.

4) 혈청 검체는 증발 및 오염으로부터 보호하여 저장하면 2~8℃에서 3일간 안정하다.

5) 장기간 보존할 때는 -20℃이하에서 동결하여야 한다.

6) 검체의 동결/용해의 반복을 피한다.

1) 필요한 수의 슬라이드를 냉장고로부터 꺼낸다. 호일백을 열지 않고 실온화 되도록 한다 (20분간). 모든 시약이 실온화되도록 한다.

2) 초순수로 PBS를 재조제한다. PBS를 담는 용기는 청결하고 오염이 없어야 한다. 세척하지 않은 PBS 용기는 다시 사용하지 않아야 한다.

3) 테스트 할 혈청의 스크리닝 희석을 준비한다. PBS 또는 환자 검체 희석액을 이용하여 희석할 수 있다. 거꾸로 뒤집어 섞는다. 각 실험실에서는 "연령에 기초한 정상 범위"에 기초하여 스크리닝 희석을 설정한다.

4) 만일 분석 민감도를 보기위하여 양성대조액을 사용하였다면 혈청 제조에 사용한 희석액으로 양성대조액의 2배계단희석액(serial doubling dilution)을 조제한다. 1:2 희석부터 시작하여 최소한 QC Report에 명시되어 있는 endpoint보다 한 번 이상의 것까지 계속한다.

5) 슬라이드를 호일백으로부터 항습기(humidity chamber)로 옮긴 후, 즉시 대조 액과 희석된 혈청을 25-35㎕씩 웰에 가한다. 검체가 웰을 완전히 덮도록 한다. 이 단계를 모든 슬라이드에 대해서 반복한다.

6) 항습기/슬라이드홀더를 덮고 실온에서 20분간 방치한다. (주의 : 배양기가 움직이지 않도록 한다.)

7) PBS로 슬라이드를 간단히 세척한다. PBS가 각 웰 위를 세척하도록 웰 위에 흘려보낸다. 이때 PBS를 웰에 직접 가하지 않는다.

8) PBS로 채워진 염색용 접시에서 10분간 슬라이드를 세척한다. 세척하는 동안염색 접시를 부드럽게 몇 번 교반하거나 magnetic stirrer를 사용한다.

9) 각 슬라이드 혹은 슬라이드 홀더를 염색접시에서 꺼내고 blotting strip을 이용하여 웰 주위의 과도한 PBS를 흡수한다. 스트립이 기질에 직접 닿지않도록 한다.

10) 슬라이드를 항습기(humidity chamber)에 놓고 즉시 대략 25㎕의 FITC 콘쥬게이트를 각 웰에 가한다. 이 스텝을 모든 슬라이드에 대해 반복한다.

11) 항습기/슬라이드 홀더를 실온에서 20분간 방치한다.

12) PBS를 흘려 슬라이드를 가볍게 헹군다.

13) 슬라이드를 PBS로 채운 염색 접시 안에서 10분간 세척한다. 또는 대조염색을 실시한다(선택과정임). : Evans’ Blue 대조염색액을 염색접시 안 PBS에 넣고(2-5방울/PBS 150mL) 슬라이드를 10분간 세척한다.

14) 각 슬라이드 혹은 슬라이드 홀더를 PBS에서 꺼내고 종이 타월 위에서 간단히 액체를 버린다. 슬라이드 홀더를 사용하였다면 슬라이드를 떼어낸다. 슬라이드마다 봉입제 4±1방울을 가하고 커버슬립을 덮는다.

15) 어두운 곳에서 형광현미경으로 슬라이드를 관찰한다. 각 기질 웰에 대하여 자가항체의 존재와 부재를 검사한다. 봉입제는 반영구적이므로 슬라이드가 어두운 곳에서 2-8℃에 보관되었다면 1-2주 후에 다시 확인할 수 있다. HEp-2 기질에 대한스크리닝 배율은 광원과 현미경의 렌즈에 근거하여 각 실험실에서 결정하여야 한다. (200X가 추천된다.) 패턴 해석 시에는 전체 ~400X - 600X 배율의 건조된 렌즈를 사용한다.

16) 염색 패턴을 결정하고 기록하며, 다음의 기준을 사용하여 강도의 등급을 매긴다.

ㆍ +4 빛나는 사과빛 녹색의 형광

ㆍ +3 밝은 사과빛 녹색의 형광

ㆍ +2 분명하게 구분되는 양성 형광

ㆍ +1 염색이 배경 형광에서 분명하게 구분되도록 하는 가장낮은 특이적 형광

1) 양성 및 음성 대조액이 모두 각 분석 시마다 포함되어야 한다.

2) 양성대조액(HOMOGENEOUS)은 핵 전반에 걸쳐 고른 핵 염색을 보여야 한다. 분리되고 있는 유사분열 세포에서는, 염색질(chromatin)에서 불규칙한 모양의 덩어리로 형광을 나타낼 것이다. 염색질은 종종 분리되는 유사분열 세포에서 더 강한 형광을 나타낸다. 분석의 민감도를 관찰하기 위해서, 염색은 QC Report에 제시된 Control 역가의 1(+ 혹은 -) dilution 내에서 +1이어야 한다. Control 역가는 현재 제조되는Bio-Rad Laboratories FITC Conjugate를 사용하여 세 롯트 이상의 Bio-Rad Laboratories substrate slides로 결정된다. 실제 실험실에서 나타나는 control 역가는 기술, 해석, 혹은 현미경 차이로 인하여 플러스 혹은 마이너스 1 doubling dilution 이내에서 달라질 수 있다. 만일 결과가 2 혹은 그 이상의 doubling dilution으로 다양한 경우 한국바이오래드㈜에 문의한다.

3) 음성대조액 : 분명한 패턴이 없고 핵과 세포질 사이에 분명한 차이가 없다.

각 웰 내의 HEp-2 세포는 세포분열 중간기에 존재하는 세포들의 혼합체이며 여러 유사분열 상태가 나타난다. 유사분열은 4기로 나뉘어 지는 세포 분열의 과정이다: (1) 전기 (2) 중기 (3) 후기 (4) 말기. 유사분열 동안에는 핵막이 소실되고 염색체는 각 기의 특징을 나타내는 배열로 쉽게 관찰된다. 각 검체의 휴지세포와 유사 분열세포 반응을 평가한다. 유사분열세포는 중기에 반드시 보여야 한다.

I. HEp-2 기질에서 형광의 특이 형태가 관찰되지 않거나, 형광이 1+보다 작으면 자가항체 테스트에 음성이다.

II. HEp-2 기질에서 특이적인 형광 패턴이 나타나며 형광 강도가 1+과 같거나 그보다 크면ANA 테스트에 양성이다.

<항핵항체 형광패턴>

A. HOMOGENEOUS(DIFFUSE) – 핵이 완전히 염색된다. 유사분열 세포는 염색체가 불규칙한 모양의 집체로 염색된다. 이 PATTERN의 조합은 nDNA, histones, 또는 DNP의 자가항체로 본다.

B. RIM (PERIPHERAL) – 핵가장자리가 더욱 진하게 염색된다. 유사분열세포는 염색체가 불규칙한 모양의 집체로 염색되며, 염색체의 가장자리가 더욱 진하게 염색된다. 이 pattern의 조합은 nDNA 또는 DNA histone complexes의 자가항체로 본다. 만약 유사분열세포의 염색체가 음성이면 rim nuclear pattern은 핵막의 자가 항체로 본다.

C. SPECKLED. Speckled pattern 1과 2는 Sm, RNP, Scl-70, SSA, SSB, 그 외의 미확인된 항원들에 대한 자가항체로 간주한다.

① FINE SPECKLED – 동일한 모양의 작은 형광점들이 핵 전반에 산재해 있으며 핵 테두리는 분명하게 나타난다. Fine speckle 내에 몇몇 coarse speckles가 산재되어 발견 되기도 한다(특히 MCTD에서). 유사분열 중인 세포질에서는 fine speckling을 유지하지만 유사분열 중인 염색체에서는 음성 반응을 보인다.

② COARSE OR ATYPICAL SPECKLED – 동일한 모양의 중간크기 형광점들이 핵 전반에 산재해 있으며 핵 테두리는 분명하게 나타난다. 유사분열 세포의 염색체는 음성이다. 드물게, 너무 많은 수이거나 크기가 다양하다는 점을 제외하고 nucleolar pattern을 나타내는 더 큰 speckles가 존재할 수 있다. 참고) 항-Scl-70은 상기 패턴에 예외이고 유사분열 염색체 영역이 양성이다. 이 항원은 염색체와 관련되어 있으며 핵인이 염색되어 발견되기도 한다.

③ DISCRETE SPECKLED(CENTROMERE SPECIFICITY) – 동일한 모양의 중간 크기 형광 점들이 핵 전반에 산재해 있으며 핵 가장자리가 뚜렷하지 않다. 유사분열 세포에서는 염색체 집단에만 집락으로 존재한다. 유사분열 전기동안 speckle 집락은 염색체 집단이 흐리게 나타난 것처럼 보인다. 중기와 후기동안 speckles는 염색체에 국한되고 더욱 명확한 막대 모양으로 나타날 수 있다. 이 pattern의 특성은 중심절이 있으며 증식성 전신 경변증의 crest 증후군과 높은 상관관계를 갖는다.

D. NUCLEOLAR – 핵소체가 진하게 동일 염색되었다면 휴지 핵의 약한 형광 염색과 관련되는 경우가 대부분이다. 세포 염색체는 음성이지만, 일부 핵소체 항체가 염색체와 반응할 수 있다. 유사분열세포는 뚜렷한 핵소체를 갖지 않는다. 이 pattern은 4-65 RNA의 자가 항체로 본다.

E. SPINDLE – 유사 분열이 진행 중인 세포는 spindle 형태로 형광이 나타난다. Spindle은 중심체로부터 뻗어 나온 방추사의 망상구조로 되어 있으며 각 중심체와 연결되어있다. 이 pattern은 항원과 관련된 미세관의 자가항체로 본다.

III. 세포질 염색 반응으로 미토콘드리아(AMA) 또는 민무늬근(ASMA) 자가항체를 추정할 수 있다. Mouse kidney 또는 mouse stomach 기질을 이용하면 더 확실히 측정할 수 있다.

A. MITOCHONDRIAL-중간기와 유사분열세포의 세포질에서 섬유상 망상 구조에 세포질 speckle이 매우 많이 존재하며 AMA의 양성 실험으로 본다. 한정된 수의 형광 소립자가 핵 표면을 가로질러 나타날 수 있다.

B. SMOOTH MUSCLE-ASMA의 양성 실험은 2가지의 pattern이 관찰된다.

1) Actin, myosin, tubulin에 대한 IgG 또는 IgM 항체가 세포질에서 면사 형태의 비치는 형광을 나타낸다. Actin과 myosin은 미세섬유의 단백질 성분이고, tubulin은 미세관의 단백질 성분이다.

2) 거미줄 모양의 망상 형광과 세포막으로부터 뻗어 나온 원섬유가 세포질 전체에 나타난다. 유사분열 세포는 세포질에 큰 형광 반점을 나타내는데, 염색체 집체는 음성이다. 이런 유형의 염색은 세포질에 있는 중간섬유의 단백 성분인 비멘틴 또는 케라틴에 특이적인 IgG 또는 IgM 자가항체로 볼 수 있다.

IV. 만일 검체가 스크리닝 희석 시에 자가항체에 대하여 양성이면, 검체를 계대 희석하고 이를 가지고 다시 테스트하여 그 역가를 측정한다. 자가항체의 역가는 15번 단계에서의 배율에서 기질에 대하여 +1의 특이 형광을 보이는 가장 높은 희석도이다.

V. 만일 Evan’s Blue 대조염색을 사용하면, 세포는 적색-오렌지색으로 나타날 것이며 특이적인 apple-green 형광의 존재 여부를 관찰하여야 한다.