인유두종 바이러스 유전형 판별용 피엔에이 칩 (PANArrayTM HPV Genotyping Chip) - 의약품 상세정보

가. 진료 담당 의사가 자궁 경부에서 cytobrush를 이용하여 자궁경부 탈락세포를 취한다.

나. 각 병원 및 임상검사센터에서 공급하는 전용 용기(예:1.5㎖ 튜브나 15㎖ conical 튜브에 PBS나 생리 식염수를 1㎖ 정도 넣어 공급하는 용기)에 넣어 밀봉한다.

다. 디엔에이를 추출하기 전까지 냉장(-4℃)에서 28일까지 보관가능하다.

3.1 PANArray^™ HPV PCR 반응의 준비

가. PANArray^™ HPV PCR 혼합액 #1 튜브에는 PANArray^™ HPV PCR 프라이머 #1을 3㎕ 첨가하고, PANArray^™ HPV PCR 혼합액 #2 튜브에는 PANArray^™ HPV PCR 프라이머 #2를 3㎕ 첨가한다.

3.2 교잡반응 준비

가. 인큐베이터를 50℃로 맞추고, 교잡반응을 위한 밀폐용기와 칩 슬라이드 1장당 700㎕분량의 교잡 용액 #1을 인큐베이터에 넣는다.

나. 슬라이드 워머는 50℃로 맞춘다. 칩을 꺼내어 슬라이드 워머 위에 올려놓는다.

다. 20X 칩 세척용액은 1X 500㎖이 되게 희석하여 준비한다.

5.1 임상 검체로부터 디엔에이 추출

5.1.1 디엔에이 추출

표1에 제시한 디엔에이 추출 키트를 사용하여 디엔에이를 추출한다.

추출 방법은 각 제조사에서 제시하는 방법(manual)에 따라 수행한다. 각 키트의 게놈 디엔에이의 증폭 효율이 달라 중합효소연쇄반응에 영향을 줄 수 있는 디엔에이의 농도 및 순도가 차이가 날수 있으므로 게놈 디엔에이 추출 후 아래 5.1.2 항에 설명한 방법에 따라 농도 및 순도를 측정하여 PANArray^™ HPV Genotyping Chip 을 이용한 인유두종바이러스 감염 진단에 적합한지 여부를 확인하여야 한다.

표1. 적용 가능한 게놈 디엔에이 추출방법

5.1.2 디엔에이 농도 및 순도 측정

가. 자외선 분광기(UV Spectrophotometer)나 ND-1000(나노드랍 테크놀로지, A029)를 사용하여 260nm와 280nm 두 파장에서의 흡광도(Absorbance 또는 Optical Density)를 측정한다.

나. 파장 260nm에서의 흡광도(A₂₆₀)와 파장 280nm에서의 흡광도(A₂₈₀)의 비 (A₂₆₀/A₂₈₀)가 1.8 이상인지 확인하고, 1.8 미만일 경우 사용한 게놈 디엔에이 추출법에서 추천하는 추출 후 정제과정을 수행하여 순도를 향상시킨다.

다. A₂₆₀/A₂₈₀가 1.8 이상인 경우, 추출한 게놈 디엔에이 농도는 50X A₂₆₀㎍/㎖으로 산출할 수 있다.

라. PANArray^™ HPV Genotyping Chip을 이용한 인유두종바이러스 감염 진단에 적합한 게놈 디엔에이 농도는 20㎍/㎖ 이상, 순도는 A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8 이상이다.

마. 추출된 디엔에이는 바로 시험에 사용하거나 30일 이내에 사용할 경우 4℃에 보관하며, 장기간 보존을 위해서는 -20℃에 보관하여야 한다.

5.2 중합효소연쇄반응

-추출한 검체 디엔에이를 가지고 중합효소연쇄반응 증폭할 때 본 키트의 구성물인 양성대조액과 음성대조액도 같이 수행한다.

가. 필요한 검체 수 만큼 PANArray^™ HPV PCR 혼합액 #1 튜브에는 PANArray^™ HPV PCR 프라이머 #1을 3㎕ 첨가하고, PANArray^™ HPV PCR 혼합액 #2 튜브에는 PANArray^™ HPV PCR 프라이머 #2를 3㎕ 혼합하여 제조한다. 각각의 튜브에 검체 디엔에이 추출물을 5㎕ 씩 넣는다.

나. 준비된 튜브를 살짝 볼텍싱 하여 섞어준 다음, 원심분리기를 이용하여 스핀다운 시킨다음 중합효소연쇄반응 기기에 넣어 반응 시킨다.

※ 본 제품에 사용할 수 있는 중합효소연쇄반응용 기기로 Bio-RAD DNAEngine^®(Bio-Rad, 미국), Takara PCR Thermal Cycler Dice(Takara, 일본), MyGene^™ Series peltier thermal cycler(Long Gene, 중국)가 테스트되었음.

다. 동일한 디엔에이 추출물을 넣은 PCR 혼합액 #1(HPV)과 PCR 혼합액#2 (HBB) 1개씩을 한 세트로 중합효소연쇄반응 기기에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.(표 2)

표2. HPV& HBB 중합효소연쇄반응 조건

5.3 중합효소연쇄반응 결과 확인

가. HPV PCR 증폭산물 5㎕ 와 HBB PCR 증폭산물 5㎕ 를 각각 6X 로딩다이( loading dye) 2㎕ 와 섞는다.

나. 0.5X TAE 완충액 100㎖에 아가로스 2g을 넣어준 다음 전자레인지에 끓여서 용해시킨다. 끓인 아가로즈젤 용액이 충분히 식은 다음 EtBR(10mg/ml) 2㎕를 첨가하여 2% 아가로즈 젤을 제조한다. 제조된 아가로즈젤을 전기영동 장치에 장착하고 0.5X TAE 완충액을 채운다. 중합효소연쇄반응 증폭 산물과 디엔에이 size 마커인 100bp ladder를 같이 로딩 한 후 전압 135 volt로 약 20 분간 전기영동한다.

다. 전기영동이 끝난 아가로즈 젤은 젤 이미지 장비에서 확인한다. 이때 HPV PCR 증폭산물에서 약 150bp, 200bp, 450bp의 증폭 산물 밴드가 나타날 수 있고 HBB PCR 증폭산물 밴드에서 130bp의 밴드가 확인된다.

5.4 교잡반응

가. 검체 수만큼 200㎕ 용량의 새로운 튜브를 준비한다.

나. 동일한 검체의 HPV PCR 증폭산물 5㎕와 HBB PCR 증폭산물 5㎕을 가)에서 준비한 하나의 튜브에 같이 넣는다.

다. 50℃인큐베이터에 들어있는 교잡용액#1에 교잡용액 #2를 아래의 표3와 같이 혼합하여 나)의 튜브에 각각 70㎕씩 넣는다.

표 3. 교잡용액의 혼합

라. 준비된 튜브를 살짝 볼텍싱 하여 섞어준 다음 원심분리기를 이용하여 스핀다운 시킨다.

마. 슬라이드 워머 위에 50℃로 10분 이상 놓아 둔 PANArray^™ HPV 칩의 커버웰 구멍에 200㎕ 파이펫을 이용하여 각각의 샘플을 주입하고, 주입이 끝난 칩은 미리 준비한 교잡반응용 밀폐용기에 담아 50℃ 인큐베이터 에서 1시간 놓아둔다.

5.5 세척 및 건조

가. 교잡반응이 끝난 칩은 인큐베이터에서 꺼내어 칩 위에 부착된 커버웰을 제거한다.

나. 20장용 알루미늄 랙에 칩을 넣고 유리용기(glass jar)에 넣는다.

다. 나.의 유리용기에 1X PANArray^™ HPV 세척용액 250㎖를 넣은 후 마그네틱 바를 회전시켜 5분간 2회 세척한다.

라. 세척이 끝난 칩은 알루미늄 랙에 꽂혀진 상태에서 원심분리기를 사용하여 칩에 남아있는 용액을 제거시킨다.

5.6 반응 결과 확인 및 분석

가. 스캔 사양 및 분석조건

(1) 스캐너 PANArray^™ HPV Genotyping Chip의 결과 판정을 위한 형광스캐너로는 MDS 사의 GenePix^® 4000B를 사용한다.

(2) 스캔 조건으로 Laser 파장은 635nm, Laser 파워는 100%, PMT gain은 700으로 설정한다.

(3) 스캔한 PANArray^™ HPV Genotyping Chip 영상으로부터 결과 판정을 위한 각 스팟의 신호(intensity)값을 분석한다.

(4) 스팟의 시그날(intensity)값 분석은 PANArray^™ HPV Genotyping Chip의 각 스팟 이미지 화소의 F635에서 Background 635(B635)를 뺀 median 값(Signal Median Value(SMV) = F635 Median - B635 Median)을 사용한다.

(5) 인유두종바이러스 유전형 마다 2개 스팟의 SMV값을 구한다.

(6) HBB의 2개 스팟의 SMV값을 구한다

(7) 위치표식자 PM의 4개 스팟의 SMV값을 구한다.

(8) 총(HPV 32X2=64개 HBB 1x2=2개, PM 1x4=4 총 70개 값의 SMV값으로 결과를 판정한다.

(9) 위치표식자 프로브는 인유두종바이러스의 유전형별 판독에는 영향을 주지 않으며 다만, 인유두종바이러스 프로브 위치에 대한 기준 역할을 한다.

나. 분석방법

(1) 형광 스캐너와 연결된 컴퓨터를 켠다(그림1).

그림1. 형광 스캐너와 연결된 컴퓨터

(2) 형광 스캐너의 전원 박스 전원을 켠다(그림2).

그림2. 형광 스캐너의 전원 박스

(3) 형광 스캐너 덮개를 가볍게 좌측으로 밀어서 연다(그림3).

그림3. 형광 스캐너 덮개를 연다

(4) 슬라이드 홀더 덮개를 열어서 위로 올린다(그림4).

그림4. 슬라이드 홀더를 연다

(5) 슬라이드의 분석할 면이 아래쪽으로 향하도록 홀더 안에 슬라이드를 넣고 왼쪽 버튼을 왼쪽으로 눌러서 슬라이드가 홀더 바닥으로 들어가게 한다(그림5).

그림5. 홀더 내 슬라이드 장착

(6) 슬라이드 덮개를 소리가 나도록 가볍게 눌러 닫는다(그림6).

그림6. 슬라이드 덮개 닫음

(7) 형광 스캐너의 덮개를 우측으로 가볍게 밀어서 닫는다.

(8) 형광 스캐너 작동 프로그램(GenePix Pro 6.1)을 실행한다(그림7).

그림7. 형광 스캐너 작동 프로그램 실행 아이콘

(9) 그림8과 같은 화면이 나오는 것을 확인할 수 있다.

그림8. 형광 스캐너 작동 프로그램 화면

(10) 컴퓨터 화면에서 그림9와 같은 아이콘을 선택한다.

그림9. 파장입력 아이콘

(11) 그림10과 같은 창이 나오면 조건값(파장 635, Laser power 100, PMT gain 700, Pixcell size 20㎛, lines to average 1, focus position 0㎛)을 입력한다.

그림10. 파장 입력창

(12) 컴퓨터 화면에서 그림11와 같은 preview scan 아이콘을 작동하여 스캐닝 하고자 하는 위치의 스캐닝 영역을 조절한다.

그림11. 미리보기 아이콘

(13) 그림12의 “⑦” 아이콘을 선택한 후 이미지 영역을 설정해 준다.

그림12. 영역설정

(14) 컴퓨터 화면에서 그림13와 같은 아이콘을 선택하여 이미지를 스캔한다.

그림 13. 이미지 스캔 실행 아이콘

(15) 컴퓨터 화면에서 그림14와 같은 그리드 아이콘 탭을 선택한다.

그림14. 블록설정 탭

(16) 그림15과 같은 창이 나오면 값(Number of column=9, column spacing(㎛)=500, Number of row=9, Row spacing(㎛)=500, Feature diameter(㎛)=240, Rotation(degrees)=0)을 입력하고 “OK"버튼을 선택한다.

그림15. 블록설정 값 입력

(17) 그림16과 같이 블록이 나타나면 이미지에 맞추어 겹쳐놓는다.

의 아이콘을 사용하여 스팟과 그리드를 일치시킨다.

그림16. 이미지 매칭

(18) 그림17에서 “⑧” 아이콘을 선택 한 후 드롭다운 메뉴 중에 “Align Features in All Blocks”를 선택한다.

그림17. 신호인식을 위한 탭

(19) 그림18와 같이 변하는 것을 확인 할 수 있다.

그림18. 신호인식

(20) 컴퓨터 화면에서 “⑨” 아이콘을 선택한 후 “Save Images" 선택하여 이미지를 저장한다(그림19).

그림19. 이미지 저장

(21) 컴퓨터 화면에서 그림20과 같은 아이콘을 선택한다.

그림20. 신호수치화 아이콘

(22)㉒ 그림21와 같은 화면이 나오는 것을 확인할 수 있다.

그림21. 신호 수치화

(23)㉓ 컴퓨터 화면에서 “⑩” 아이콘을 선택한 후 “Save Results As.”를 선택하여 이미지를 저장한다(그림22).

그림22. 신호수치 저장

5.7 결과 판정

5.7.1 음성일 경우

가. HBB의 SMV값이 1,000이상 이고 인유두종바이러스 32가지 유전자형 각각의 SMV값이 1,000 미만일 경우 PANArray^™ HPV Genotyping Chip에서 검출 가능한 32종의 인유두종바이러스에 대해서 음성으로 판정한다.

5.7.2 양성일 경우

가. HBB의 SMV값이 1,000이상이고 각 유전자형의 SMV값이 1,000이상 일 경우 해당 유전자형의 인유두종바이러스 감염을 양성으로 판정한다 (해당 인유두종바이러스 유전자형 스팟 2개가 모두 SMV값 1,000이상이어야 한다).

< SMV값 결과 판정기준 정리>

5.7.3 판정 불가 혹은 재시험

가. HBB의 SMV값 중 1개라도 1,000 미만일 경우 결과 판정이 불가능하므로 재시험한다.

나. 인유두종바이러스 유전형 32종(동일 유전형 1개 당 2개 스팟) 스팟에서, 동일 유전형 스팟 2개 중 1개의 SMV값이 1,000 이상이고 다른 1개의 SMV값이 1,000 미만인 경우, 결과 판정이 불가능하므로 재시험을 실시한다.

다. 각각의 위치표식자 프로브의 SMV값이 55,000 미만일 경우에는 재시험을 실 시한다.

<재시험 결과의 판정기준>

X : 하나의 스팟은 양성이고 다른하나의 스팟은 음성인 경우

O : 두 개의 스팟이 모두 양성인 경우

5.7.4 인유두종바이러스 유전형 결정

다음의 결과 분석표를 참조하여 인유두종바이러스 유전형을 결정한다.

가. 아래의 그림과 같이 고위험군 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73과 저위험군 6, 11, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 62, 81, 83 각 유전형에 대해서 2개 스팟씩 배열되어 있다.

* G; HBB 프로브(PCR의 무오류성을 확인하기 위해 사용)

* PM(Position Marker); 위치마커(프로브 위치를 확인하기 위해 사용)

나. 판정 예시(표4. 참조)

<양성의 경우>

① 모든 HBB 프로브 자리에서 SMV값이 1,000 이상

② 인유두종바이러스 18번 프로브 자리의 스팟 2개 모두 SMV값이 1,000 이상임.

③ 위의 조건을 모두 만족 할 때, 인유두종바이러스 유전형 18번에 감염되었다고 판정한다.

<음성의 경우>

① 모든 HBB 프로브 자리에서 SMV값이 1,000 이상

② 인유두종바이러스 프로브 자리의 모든 스팟 SMV값이 1,000 미만임.

③ 위의 조건을 모두 만족 할 때, 인유두종바이러스 음성으로 판정한다.

표4. 판정예시

6.1 본 제품의 사용 시 한번 검사할 때마다 양성대조와 음성대조를 포함하여 시험하여야한다.

6.2 양성대조는 인유두종바이러스 18 유전자형 프로브와 HBB 프로브 의 SMV값이 1,000 이상의 값이 나와야 하고 나머지 스팟에서는 1,000 미만으로 나와야 한다.

6.3 음성대조는 HBB 프로브를 제외한 모든 프로브의 SMV값이 1,000 미만이어야 한다.