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(1) Agar disc diffusion method로 일정 농도의 항균제를 건조여과지에 포화시킨 디스크와 균액이 접종된 배지와의 반응으로 생성된 Zone Diameter를 측정한다.

(2) 순수 배양된 균만을 사용한다. 일반적인 균에 대해서 Mueller-Hinton 배지를 사용하며 배양이 까다로운 균에 대해서는 다음과 같은 배지의 사용이 권장된다.

(1) 디스크를 사용하기 1시간 전에 상온이 되도록 한다.

(2) 진단할 검체는 신선한 상태이어야 하므로 가능하면 검사 전에 채취하여 사용한다.

(3) 기타 검사에 필요한 기구 및 시약 등을 준비한다.

(1) 시험 및 대조 배양의 접종액 조제

① Gram 염색을 하여 순수 배양된 것이 확인된 균만 사용하며 대조균은 3. 사용방법의 (8)결과 판정표의 Control Zone Diameter Limits항에 언급된 균주를 사용한다.

② 시험하려는 균주에 적합한 플레이트에서 순수 배양된 시험균 colony 3-5개를 선택하여 접종루프 등을 사용하여 4-5mL의 시험하려는 균주에 적합한 broth배지에 옮긴다.

③ ②의 배지를 35℃에서 2-6시간 동안 배양한다. 이때 중등도의 탁도가 생성되도록 한다. 또는 18-24시간 동안 시험하려는 균주에 적합한 agar 플레이트에 배양한 집락을 직접 broth나 생리식염수에 현탁하여 준비한다.

④ 최종 탁도는0.5 McFarland 표준액과 동등하여야 한다. 0.5 McFarland표준액은 0.5mL의 0.048mol/L Barium Chloride를 99.5mL의 0.18 mol/L 황산에 가하여 얻어진다. 이때 동일 탁도를 위해 broth나 생리식염수로 희석할 수 있다.

접종액은 광도계를 사용하여 확인할 수도 있다. Enterobacteriaceae나 Staphylococci 등은 반드시 희석하여 사용한다.

⑤ 대조균에 대하여도 같은 조작으로 접종액을 준비한다.

(2) 접종

① 15분 이내에 최종 접종액에 멸균봉을 담근다. 멸균봉에 묻은 과량의 접종액을 시험관 내벽을 이용하여 제거한다.

② 시험할 균과 대조균의 접종액을 각각 배양하기에 적절한 agar 플레이트의 전체 표면에 골고루 접종되게 하기 위해 플레이트를 60°씩 회전하면서 도말한다.

③ 플레이트의 뚜껑을 닫고 적어도 3분-15분간 상온에 방치한다.

(3) 적당한 디스크를 선택한다.

(4) Bio-Rad 디스크 분배기를 사용하여 agar 표면에 디스크를 놓는다. 디스크의 분배는 대조균의 저지원이 겹치지 않을 정도로 충분한 간격이 되도록 한다. 만일 디스크 분배기를 사용하지 않고 디스크를 놓을 때는 agar 표면에 잘 접촉되도록 멸균된 핀셋이나 바늘로 가볍게 눌러준다.

(5) 15분 이내에 35 ± 2 ℃가 유지되는 배양기에 플레이트를 넣는다.

(6) 16-18시간(Acinetobacter spp.는 20-24시간) 배양 후 플레이트를 검사하고 만일 필요하면 다시 배양한다. 분리된 집락으로 성장을 나타내면, 너무 엷게 접종한 것이므로 시험을 반복해야 한다.

(7) 시험균과 대조균의 Zone Diameter를 측정한다.

(8) 결과 판정

다음 표에 따라 판정한다.