모자이크 헵-20-10/리버 멍키(Mosaic HEp-20-10/Liver Monkey) - 의약품 상세정보

1) 안정성 : Serum과 plasma 검체는 일반적으로 +2℃~+8℃에서 14일 안에 저장된 것이 조사되어진다. 냉장고에 장애가 없다는 조건으로 28일 동안 검체의 저장이 가능하다. 이 경우, 검체는 육안과 냄새(후각이 지적하는 박테리아의 오염 발생)로 확인되어야 한다. 뇌척수액 검체(cerebrospinal fluid samples)는 일주일 안에(+2℃~+8℃에 저장) 검사되어야 한다. 희석된 검체는 하루 일과 동안에만 배양(incubate)된다.

*임상화학과 혈액학 파라미터를 위해서는 다른 조건이 적용된다.

2) 정성 평가를 위한 검체 희석

classes IgG의 항체 결정 : serum 검체를 검사하려면 PBS-Tween으로 1:100 희석한다. 예를 들면, 11.1ul 검체를 1000ul PBS-Tween에 희석하고 충분하게 혼합 시킨다. (즉, 4초 동안 볼텍스)

3) 정량 평가를 위한 검체 희석

검사를 하기위한 serum 검체의 희석은 PBS-Tween을 사용한다. 각각 100ul PBS-Tween을 튜브에 넣고 다음 단계로 높은 농도를 46.3ul를 혼합한다. . (즉, 2초 동안 볼텍스)

주의 : 한 Lot의 각각의 시약은 다른 Lot의 시약과의 혼합 사용을 금한다.

1) 슬라이드(Slides) : 바로 사용 가능. 오직 실온에 도달하였을 때에만(그렇지 않으면 응축된 물이 기질에 손상을 준다) 보호 커버를 제거한다. Felt-tip 팬으로 표시한다. BIOCHIPs은 만지지 않는다. 보호 커버를 제거한 후 이 슬라이드는 15분 정도 보온(incubate)한다. 만약 보호 커버가 손상을 입었다면 이 슬라이드는 진단에 절대 사용하지 않아야 한다.

2) Fluorescein-labelled secondary antibody(FITC) : 1:5의 비율로 PBS-Tween과 희석한다. 처음 FITC를 사용하기 전에 파이펫으로 완전하게 혼합한다. Aliquot으로 요구되는 양만을 이동시키고 이것은 희석한 같은 날에 사용한다.

3) 양성 및 음성대조 혈청 : 바로 사용 가능. 처음 대조혈청을 사용하기 전에 파이펫으로 충분하게 혼합한다.

4) PBS-Tween : “Salt for phosphate buffer” 한 팩을 1 리터의 증류수(최적조건 : aqua pro infusione)에 용해 시키고 거기에 Tween 20 2ml을 혼합한다. 준비된 PBS-Tween은 일반적으로 +2℃~+8℃에 1주일간 저장한다. PBS-Tween이 만약 혼탁하거나 오염이 나타나면 사용하지 않는다.

5) Embedding medium(포매,包埋, 매질) : 바로 사용 가능.

TITERPLANE Technique는 면역분석시험(immunological analyses)을 표준화하기위해 EUROIMMUN에 의해 개발되었다 : 검체나 labelled antibodies는 reagents’ support의 반응 필드의 표면에 붙인다. BIOCHIP 슬라이드는 reagents’ support(슬라이드의 모든 BIOCHIP에 유체에 접촉된다.)의 함요(陷凹, recess)로 옮긴 다음 개별적인 반응이 동시에 시작된다. 소적(小滴, droplets)의 위치와 높이는 시스템의 기하학에 의해 정확하게 결정된다. Fluid는 폐 쇠 공간에 제한함으로써 전통적인 “humidity chamber”가 필요 없게 되었다. 이것은 많은 수의 검체와 다음의 다른 샘플을 동시에 동일 조건에서 incubate하는 것을 가능하게 하였다.

1) Prepare(준비) : Reagent support를 점검한다. 시약과 검체에 대한 준비는 앞 페이지에 이미 기술하였다.

2) Pipette(파이펫) : 희석 검체 25ul를 reagents’ support의 각 반응 필드에 떨어뜨린다. 양성 및 음성 컨트롤은 희석하지 않고 바로 사용한다. 이때 공기 방울은 피한다. Incubation을 시작하기 전에 (200 droplet 까지) 검사할 모든 검체를 옮긴다. Polystyrene pipetting template를 사용한다.

3) Incubation : BIOCHIP 슬라이드가 reagents’ support의 대응되는 함요(陷凹, recess)와 합치됨으로서 반응이 시작된다. 각 검체는 BIOCHIP과 접촉을 확실하게 하여 개별적인 검체가 다른 검체와는 접촉되지 않게 한다. 실온에서 30분간 incubation 한다.

4) Wash(세척) : BIOCHIP 슬라이드는 비이커를 사용해서 PBS-Tween을 흘려 씻어내리고 이것을 그 후 즉시 최소 5분간 PBS-Tween이 담겨있는 큐벳에 담근다. 만약 가능하다면 rotary shaker를 이용하여 shaking한다.

5) Pipette : 세척된 reagents’ support의 각 field에 20 ul fluorescein-labelled anti-human globulin (conjugate)을 떨어뜨린다. 연속된 incubation 전에 모든 droplets(최대 50 슬라이드의 시약)을 하여야 한다. Stepper pipette을 사용한다. Fluorescein-labelled anti-human serum(conjugate)은 사용 전에 파이펫을 이용하여 섞여야 한다.

6) Incubation : PBS-Tween으로부터 하나의 BIOCHIP 슬라이드를 옮긴다. 5초 이내에 오직 여백과 장축(long sides) 부분의 얼룩을 제거하고 즉시 reagents’ support의 함요(陷凹, recess)에 놓는다. 반응 필드 사이의 부분은 건조 시키지 않는다. BIOCHIP과 liquids 사이가 잘 접촉되었는지 확인한다. 그리고 나서 다음 BIOCHIP 슬라이드를 진행한다. 이제부터는 직사광선으로부터 슬라이드를 보호한다. 실온에서 30분간 incubation 한다.

7) Wash(세척) : BIOCHIP 슬라이드는 비이커를 사용해서 PBS-Tween을 흘려 씻어내리고 이것을 그 후 즉시 최소 5분간 PBS-Tween이 담겨있는 큐벳에 담근다. 만약 가능하다면 rotary shaker를 이용하여 shaking한다. 대비염색(counterstaining)을 위하여 Evns Blue 10 drop을 각 150 ml phosphate buffer에 첨가한다.

8) Embed : 커버 글래스위에 glycerol/PBS를 반응 필드 당 10 ul씩 분주한다. Polystyrene embedding template를 사용한다. PBS-Tween으로부터 BIOCHIP 슬라이드를 제거한 후 후면, 모든 사면, 주위 표면을 말린다. 그러나 종이 타월로 반응 필드 사이는 말리지 않는다. BIOCHIP 슬라이드를 준비된 커버 글래스 위에 뒤로 뒤집어 놓는다. 커버 글래스가 슬라이드의 홈에 적합하게 끼워져 있는지 즉시 확인한다. 가능하다면 정확한 위치에 올 수 있게 한다. 다음번의 BIOCHIP 슬라이드도 동일한 방법으로 실행한다.

9) Evaluate : 형광 현미경(fluorescence microscopy )으로 검경한다.

1) Fluorescence pattern (positive reaction) : Antibodies against nuclear antigens (ANA)는 수많은 기질(substrate)을 검출할 수 있다. 목적물 결정을 위해서는 ANA 분화, human epithelial cells(HEp-20-10)과 primate liver로 조합 구성된 기질이 적합하다. cell nuclei는 명백하게 형광(확실한 패턴에 의해 특징지어지는)으로 보여진다. 음성 검체의 경우에 있어서 nuclei는 특정적인 형광이 나타나지 않는다. 각 필드의 평가에서는 HEp-2 cells과 마찬가지로 liver에서도 모두 분열중간기 핵(interphase nuclei)과 유사분열 셀(mitotic cells)이 가능하다면 여러 영역에서 평가되어야 한다.

2) Qualitative evaluation(정성 평가) :

3) Quantitative evaluation(정량 평가) : 이 역가(titer)는 특별한 형광이 정확하게 일치하기 위한 검체 희석 인자(sample dilution factor)에 의해 결정된다. 이것은 희석한 음성 검체와 동일하게 사용해서 얻은 반응과 비교되어야 한다. 대부분 중요한 형광 패턴의 일부는 핵과 동원체(nuclei and centromere)와 마찬가지로 균질하고(homogeneous) 과립성 핵 형광(granular nuclear fluorescence)으로 나타난다. 관련된 결합 패턴은 때때로 생화학적으로 nuclear antigens으로 판명된 것과 일치한다.

간접적 면역형광법에 의한 antinuclear antibodies의 검출을 위해서 환자의 검체는 요즘 두 가지 기질(human epithelial sells(HEp-2010)와 냉동된 절편의 영장류의 간, primate liver )의 조합에 의하여 뛰어난 검사를 행한다. 형광 패턴과 비교하여 수많은 가능한 항체들의 전-분화가 만들어진다. 이 영장류의 간(primate liver)은 검출 가능한 항체의 스펙트럼이 완벽하다. ribosomal P-proteins, liver-specific protein (LSP), liver-kidney microsomes (LKM), liver cell membrane (LMA), bile ducts, endothelial cells, endomysium과 granulocytes (cANCA, pANCA)에 대한 항체가 중요하다.

기존의 Hep-2 cell과 비교하여 cell이 더 크고 분열중인 cell이 더 많이 나타난다. Coarse-granular 패턴이 크고 더 밀집되어 있다.

Antigen(항체) : 두 가지 기질(human epithelial sells(HEp-2010)과 냉동된 절편의 영장류의 간(primate liver ))의 조합에 의한 간접적 면역형광법에 의하여 ANA 항체를 검출하기 위하여 사용된다.

Stability(안정성) : 제조일로부터 12개월간 보장한다.

Measuring range(측정 범위) : 이 검사 시스템의 희석 시작점은 1:100 (IgG)이다. 검체는 더 나아가 일련의 희석이 1:32, 1:100, 1:320, 1:1000, …등으로 하기 위하여 √10 (약 3.2)의 팩터에 의해 희석된다.

만약 간접적 면역형광법(IIFA)에 의한 검사가 양성이라면, 항체가 직접 대응되는 특정한 핵의 항체를 판별하기 위해서는 다양한 단특이성 분석(monospecific analyses, 즉, enzyme immunoassays)에 의하여 추적 가능하다.