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⑴ Agar diffusion method로 일정 농도의 항생제를 건조여과지에 포화시킨 디스크와 균액이 접종된 배지와의 반응으로 생성된 zone diameter를 측정한다.

⑵ 순수 배양된 배지만을 사용한다. 일반적인 균에 대해서 Mueller-Hinton 배지 (Oxoid 제품번호 CM0337)를 사용하며 배양이 까다로운 균에 대해서는 다음과 같은 배지의 사용이 권장된다.

Haemophilus influenzae: Haemophilus Test Medium (Oxoid 제품코드 CM0898 + SR0158)

Neisseria gonorrhoeae: Vitox (Oxoid 제품코드 SR0090) 등과 같은 성장제가 1%가 함유된 GC Agar Base (Oxoid 제품코드 CM0367)

Streptococcus pneumoniae: Sheep blood가 5% 정도 함유된 Mueller-Hinton agar (Oxoid 제품코드 CM0337)

⑴ 디스크를 사용하기 1시간 전에 실온이 되도록 한다.

⑵ 검사할 검체는 신선한 상태여야 하므로 가능하면 검사 전에 채취하여 사용한다.

⑶ 그 밖에 검사에 필요한 기구 및 시약 등을 준비한다.

⑴ 시험 및 대조 배양의 접종액의 조제

① 시험할 검체는 그람 염색 (Gram staining)을 하며, 비선택배지 (혈액배지, Brain Heart Infusion Agar, Tryptone Soya Agar)에서 순수 배양된 것만을 사용한다.

② 4-5개의 분리된 집락을 선택하여 접종루프 등을 사용하여 5mL의 영양액체배지 (Mueller-Hinton Broth, Heart Infusion Broth, Tryptone Soya Broth)에 옮긴다.

③ ②의 배지를 35-37℃에서 2-8시간동안 배양한다. 이 때 중등도의 탁도가 될 때까지 배양한다. 또는 비선택 배지에서 35℃, 하룻밤 배양한 집락 중 잘 분리된 4-5개의 집락을 접종루프 등으로 채취하여 멸균 생리식염수나 영양액체배지에 옮기고 잘 섞는다.

④ 만들어진 접종액의 최종 탁도는 0.5 McFarland 표준액과 같아야 한다. 0.5 McFarland 표준액은 0.5mL의 0.048mol/L 염화바륨을 99.5mL의 0.18mol/L 황산에 가하여 만든다 (또는 Remel McFarland Tubiditiy Standard 사용(제품코드 R20410)). 탁도가 동일하지 않을 경우 액체 배지나 멸균생리식염수로 접종액을 희석할 수 있다. 접종액의 탁도는 광도계를 사용하여 확인할 수도 있다. 장내세균이나 Staphylococci는 반드시 희석하여 사용한다.

⑵ 접종

① 15분 이내에 최종 접종액에 멸균면 봉을 담근다. 접종액이 들어 있는 시험관의 위 쪽 내벽에 멸균면봉을 돌려가며 잘 눌러 과량의 접종액을 제거한다.

② Mueller-Hinton Agar 플레이트의 전체 표면에 고르게 접종되도록 접종액을 총 3번 도말하는데, 배지를 60° 정도씩 돌려서 한번씩 도말한다. 마지막으로 배지의 가장자리를 둘러가며 접종한다 (아래 그림 참조)

⑶ 적당한 항생제 디스크를 선택한다.

⑷ 멸균한 핀셋이나 Oxoid Disc Ejector 또는 Oxoid Disc Dispenser를 사용하여 접종 후 15분 이내에 배지에 디스크를 놓고 배지 표면에 잘 접촉되도록 가볍게 눌러준다. 디스크는 중심간격이 24mm 이상이 되도록 한다. 일반적으로 150mm 플레이트에는 12개 디스크까지, 100mm 플레이트에는 4개 디스크까지 놓는다. 디스크를 놓는 순간부터 항생제가 즉시 확산되므로, 디스크가 배지 표면에 일단 닿았다면 위치를 옮기면 안된다.

⑸ 15분 이내에 플레이트를 뒤집은 상태로 35-37℃ 배양기에 넣는다. Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, 일부 Streptococcus pneumoniae를 제외한 균의 플레이트는 이산화탄소가 풍부한 대기상태에서 배양하면 안된다.

⑹ 16-18 시간 동안 배양한 후 플레이트를 검사하고 만일 필요하다면 (Streptococcus pneumoniae는 18-24시간, Neisseria gonorrhoeae는 20-24시간) 다시 배양한다. 만일 분리된 집락으로 성장했다면, 옅은 농도를 접종한 것이므로 시험을 다시 실행해야 한다.

⑺ 시험균과 대조균의 zone diameter를 측정한다. 완전한 억제가 나타난 구역 (디스크의 직경을 포함)의 직경을 측정하여 밀리미터로 기록한다.

R: Resistant (내성) I: Intermediate (중간) S: Susceptible (감수성)