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(1) Agar disc diffusion method로 일정 농도의 항균제를 건조여과지에 포화시킨 디스크와 균액이 접종된 배지와의 반응으로 생성된 Zone Diameter를 측정한다.

(2) 순수 배양된 균만을 사용한다. 일반적인 균에 대해서 Mueller-Hinton 배지를 사용하며 배양이 까다로운 균에 대해서는 다음과 같은 배지의 사용이 권장된다.

Haemophilus spp. - Haemophilus Test Medium

Streptococcus spp. – 5% sheep blood가 함유된 Mueller-Hinton Agar

(1) 디스크를 사용하기 1시간 전에 상온이 되도록 한다.

(2) 진단할 검체는 신선한 상태이어야 하므로 가능하면 검사 전에 채취하여 사용한다.

(3) 기타 검사에 필요한 기구 및 시약 등을 준비한다.

(1) 시험 및 대조 배양의 접종액 조제

① Gram 염색을 하여 순수 배양된 것이 확인된 균만 사용하며 대조균은 3. 사용방법의 (8)결과 판정표의 Control Zone Diameter Limits항에 언급된 균주를 사용한다.

② 시험하려는 균주에 적합한 플레이트에서 순수 배양된 시험균 colony 3-5개를 선택하여 접종루프 등을 사용하여 4-5mL의 시험하려는 균주에 적합한 broth배지에 옮긴다.

③ ②의 배지를 35℃에서 2-6시간 동안 배양한다. 이때 중등도의 탁도가 생성되도록 한다. 또는 18-24시간 동안 시험하려는 균주에 적합한 agar 플레이트에 배양한 집락을 직접 broth나 생리식염수에 현탁하여 준비한다.

④ 최종 탁도는0.5 McFarland 표준액과 동등하여야 한다. 0.5 McFarland표준액은 0.5mL의 0.048mol/L Barium Chloride를 99.5mL의 0.18 mol/L 황산에 가하여 얻어진다. 이때 동일 탁도를 위해 broth나 생리식염수로 희석할 수 있다.

접종액은 광도계를 사용하여 확인할 수도 있다. Staphylococci 등은 반드시 희석하여 사용한다.

⑤ 대조균에 대하여도 같은 조작으로 접종액을 준비한다.

(2) 접종

① 15분 이내에 최종 접종액에 멸균봉을 담근다. 멸균봉에 묻은 과량의 접종액을 시험관 내벽을 이용하여 제거한다.

② 시험할 균과 대조균의 접종액을 각각 배양하기에 적절한 agar 플레이트의 전체 표면에 골고루 접종되게 하기 위해 플레이트를 60°씩 회전하면서 도말한다.

③ 플레이트의 뚜껑을 닫고 적어도 3분-15분간 상온에 방치한다.

(3) 적당한 디스크를 선택한다.

(4) Bio-Rad 디스크 분배기를 사용하여 agar 표면에 디스크를 놓는다. 디스크의 분배는 대조균의 저지원이 겹치지 않을 정도로 충분한 간격이 되도록 한다. 만일 디스크 분배기를 사용하지 않고 디스크를 놓을 때는 agar 표면에 잘 접촉되도록 멸균된 핀셋이나 바늘로 가볍게 눌러준다.

(5) 15분 이내에 35 ± 2 ℃가 유지되는 배양기에 플레이트를 넣는다. Haemophilus spp., Streptococcus spp.는 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양한다.

(6) 16-18시간(Streptococcus spp.는 20-24시간) 배양 후 플레이트를 검사하고 만일 필요하면 다시 배양한다. 분리된 집락으로 성장을 나타내면, 너무 엷게 접종한 것이므로 시험을 반복해야 한다.

(7) 시험균과 대조균의 Zone Diameter를 측정한다.

(8) 결과 판정

다음 표에 따라 판정한다.