비엠티 에이치피브이 9지 디엔에이 키트(BMT HPV 9G DNA KIT) - 의약품 상세정보

채취 솔을 자궁경부에 조심스럽게 삽입하여 자궁경부 세포진을 채취한 후 1xPBS (Phosphate Buffer Saline)가 2ml가 담겨져 있는 15ml 튜브에 넣는다. 채취 솔의 막대부분을 제거하고 솔의 부분만 넣어 검체채취 후 바로 시험에 사용한다. 바로 사용이 어려우면 검체 채취 후 바로 4℃ 냉장 보관하며 3일 이내에 사용한다.

3.1 디엔에이 추출

① 디엔에이 추출키트(AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit, 바이오니아사, 대한민국)는 본 제품에 포함되어 있지 않으므로 별도 구매하여 사용하며, 키트 제조사(바이오니아사) 제품 설명서의 검사과정에 따라 시험한다.

② 추출한 디엔에이는 농도가 20㎍/㎖ 이상, 순도는 A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8 이상인 것을 사용한다.

3.2 중합효소연쇄반응(PCR)

3.2.1 반응준비 및 개봉 후 시약의 보관

① 2개의 인유두종 바이러스 영역 증폭 프라이머[BMT Primer set(Primer I+II)] 튜브에 각각 300ul의 증류수를 첨가하여 완전히 녹인 후, 약 65 ul [6테스트 X 10ul(1테스트당 사용량) + 5ul)] 분량으로 분주하여 -20℃에서 냉동 보관한다 (용액 제조일로부터 6개월간 유효하다).

② 베타글로빈 영역 증폭 프라이머(Beta G(PC03+PC04)) 튜브에 600ul의 증류수를 첨가하여 완전히 녹인 후, 약 65 ul [6테스트 X 10ul(1테스트당 사용량) + 5ul)] 분량으로 분주하여 -20℃에서 냉동 보관한다 (용액 제조일로부터 6개월간 유효하다).

③ 중합효소연쇄반응(PCR) 프리믹스는 -20℃에 보관한다 (제조일로 부터 1년간 유효하다).

3.2.2 중합효소연쇄반응

① 각각의 시약을 실온에서 즉시 해동한 후 준비된 얼음위에 놓는다.

② 얼음위에 있는 중합효소연쇄반응 프리믹스 각각의 튜브에 프라이머 및 추출된 유전자를 아래와 같이 혼합한다.

③ 혼합한 시험관을 가볍게 원심분리 후 중합효소연쇄반응기(모델명 : MyGenieTM 96, (주)바이오니아, 대한민국)에 넣고 아래의 시험방법에 따라 시험한다.

※반응이 끝난 시험관은 1일을 초과할 경우 - 20℃에 보관한다.

3.2.3 중합효소연쇄반응 결과물 확인

① 2% 아가로스 젤(0.5X TAE 완충액, 10mg/ml EtBR 혼합)을 전기영동 장치에 장착하고 0.5X TAE 완충액을 채운다.

② 장착된 2% 아가로스 젤 홈 첫번째에 디엔에이 마커(100bp Plus DNA size maker) 4ul, 두 번째 홈부터 각각의 반응액 5ul씩 분주한 후 전압 100볼트로 하여 25분간 전기영동한다.

③ 전기영동이 완료되면 2% 아가로스젤을 꺼내어 UV에서 각각의 증폭산물을 확인한다. 이때 인유두종 바이러스 증폭산물은 181 bp ~ 190 bp, 베타글로빈의 경우 110 bp의 증폭 산물 밴드가 나타난다.

< 증폭된 인유두종 바이러스의 전기영동 결과 예 >

3.3 유전자 칩 교잡반응(Hybridization)

3.3.1 검사준비 및 개봉 후 시약의 보관

① 개봉된 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩은 실온에서 보관한다 (개봉일로부터 4 주간 유효하다).

② HC Cy5-DNA 튜브에 600ul의 증류수를 첨가하여 완전히 녹인 후 약 65 ul [6테스트 X 10ul(1테스트당 사용량) + 5ul)] 씩 분주한 후 -20℃에서 냉동 보관하여 사용한다 (제조일로부터 6개월간 유효하다).

3.3.2 교잡반응

① 칩 1개(6 테스트) 당, 교잡반응완충액(Hybridization Buffer) 220.5ul와 HC Cy5-DNA 용액 63ul를 혼합하여, 시험할 칩 개수에 맞추어 교잡반응용액을 제조한다.

예)

② 밀폐가 가능한 용기를 선택하여, 이 용기의 바닥에 커버웰이 부착된 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩을 배열한다. 이때 칩에 테스트할 샘플 번호를 표시한다.

③ 반응할 검체 수만큼 새로운 1.5ml 혹은 200ul 용량의 시험관을 준비한다.

④ 각각의 시험관에 ①에서 제조한 교잡반응용액 45ul, 중합효소연쇄반응 결과물 5ul을 넣고 피펫으로 잘 혼합한다.

⑤ 혼합한 시험관을 30 초간 원심분리하여 용액을 모은 후, 피펫을 사용하여 각 시험관 내의 용액을 칩 표면에 부착된 커버웰의 홀에 천천히 주입한다. 이때 칩과 커버웰 사이에 기포가 있는지 부착이 잘 되어있는지를 확인한다. 혹시 기포가 있다면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어 내어 기포를 제거한다.

⑥ 칩이 놓여있는 용기를 밀폐한 후, 18 ~ 30℃ (25℃ 권장)에서 30분 ~ 1시간 동안 교잡반응을 진행한다.

3.3.3 세척 및 건조

① 유전자 칩 세척 용액 A(Washing Buffer A)와 유전자 칩 세척 용액 B(Washing Buffer B)는 아래 예와 같이 혼합하여 각각의 세척용기에 칩이 잠길 정도로 넣어준다.

② 교잡반응이 끝난 칩을 유전자 칩 세척용액 A(Washing Buffer A)가 들어있는 용기에 넣고 용액 내에서 커버웰을 제거한 후 2분간 방치한다. (세척용액은 칩이 완전히 잠기도록 준비한다. 25℃ 권장)

③ ②의 칩을 꺼내어 유전자 칩 세척용액 B(Washing Buffer B)가 들어있는 용기에 옮겨 넣고 2분간 방치한다. (25℃ 권장)

④ 세척이 끝난 칩은 원심분리기를 이용하여 1,013g(2,500 rpm)에서 2분간 건조한다. 모든 단계에서 반응부위가 오염되거나 손상되지 않도록 조심한다.

3.4 반응 결과 확인 및 분석

3.4.1 스캐너 설정 및 구동

사용되는 스캐너 : ScanArray Gx (Perkin-Elmer life and Analytical science/미국)

① ScanArray Gx 스캐너의 전원을 켠다.

② 스캐너가 활성화가 끝나면 컴퓨터 전원을 켠다.

③ 분석할 슬라이드를 스캐너에 넣고 윈도우 화면상 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 실행한다.

④ 원하는 형광 파장을 선택(파장 635)하여 광원(laser)를 활성화시킨 후 왼쪽 상단의 scan을 클릭한다.

⑤ 다음과 같이 스캔설정을 한 후 측정한다.

- scan type : Run Easy Scan

- 스캔 시 해상도: 20um

- Fluorophore : Cy 5

- PMT gain : 표준슬라이드의 표준스팟 4의 형광감도가 45,000~56,000, 그리고 표준스팟 5의 형광감도가 22,000~27,000 이내의 값을 가지도록 스캐너의 PMT gain을 설정하여 HC가 50,000이상이 되게 조절하여 사용한다.

- Laser power : 90%

- Set scan Area

(스캔 설정을 한 후 하단의 start를 클릭하면 스캔이 시작된다.)

⑥ 스캔이 완료되면 왼쪽 상단의 file 버튼을 클릭한 후 save as를 클릭하여 원하는 폴더에 파일을 저장한다. (파일의 형태는 *.tif 와 *.jpg 형태로 저장한다.)

3.4.2 Digieye를 이용한 스캔결과 판독

Digieye를 이용한 스캔결과 판독의 순서는 다음과 같다.

Open analysis file -> 1~6의 넘버 선택 -> start analysis -> next -> select

이들 과정이 아래에 상세히 설명되어 있다.

① Digieye를 실행하기 위하여 아이콘을 더블클릭 한다.

② Open Analysis File을 클릭하여 사용자가 분석하고자 하는 파일을 선택하여 불러온다.

③ 열기 창이 나타나면 분석하고자 하는 *.tif 파일명을 더블 클릭하여 파일을 불러온다.

④ 1~6번 넘버에서 분석하고자하는 웰 위치를 선택한 후 하단의 Start Analysis를 클릭한다.

⑤ Start analysis를 클릭하면 1-6에서 선택한 영역의 스캔 결과(*.tif)가 왼쪽 창에 확대되어 나타나고 각 스팟에 붉은 색의 정해진 틀이 자동으로 맞춰진 후 하단의 Next 버튼을 클릭한다.

⑥ Next 버튼을 클릭하면 data analysis window 화면에 각 스팟의 위치와 형광분석값이 나타나게 된다. 여기서, 왼쪽 하단의 select 버튼을 클릭하면 다음의 그림과 같이 (A)영역의 기준에 따라 양성판정 기준 이상의 스팟들에 대한 정보가 (B)와 (C) Report 에 표시된다.

4.1 결과판정

인유두종 바이러스 9G 유전자 칩의 스캔 결과는 Digieye 소프트웨어에 의해 각 스팟 형광값이 자동으로 계산되어 아래의 결과판독 순서도의 과정을 통해 자동으로 판정결과를 알려준다.

< 결과 판독 순서도>

① 양성의 경우 : BG (Backgound형광) 스팟의 SMV(Signal Mean Value) : 7,000 미만, HC (Hybridization control) 스팟의 SMV : 50,000 이상, PC (Positive control) 스팟의 SMV : 10,000 이상, PCR confirm 스팟의 SMV : 10,000 이상이며, 해당 유전형의 SMV 가 20,000 이상인 경우 Digieye에서 양성으로 판정한다.

② 음성의 경우 : BG (Backgound형광) 스팟의 SMV(Signal Mean Value) : 7,000 미만, HC (Hybridization control) 스팟의 SMV : 50,000 이상, PC (Positive control) 스팟의 SMV : 10,000 이상, PCR confirm 스팟의 SMV : 10,000 미만이며, 모든 인유두종 바이러스 유전형의 SMV 가 20,000 미만인 경우 Digieye에서 음성으로 판정한다.

③ 판정불가 또는 재시험 : BG (Backgound형광) 스팟의 SMV(Signal Mean Value) : 7,000 이상, 또는 HC (Hybridization control) 스팟의 SMV : 50,000 미만, 또는 PC (Positive control) 스팟의 SMV : 10,000 미만인 경우 Digieye로 판정이 불가하여 재시험을 진행한다.

또한, 인유두종 바이러스 유전형의 SMV 가 20,000 이상으로 발현되었으나 PCR confirm 스팟의 SMV 가 10,000 미만으로 나타나는 경우도 Digieye로 판정이 불가하여 재시험을 진행한다.

4.2 결과판정기준

① BG (Background 형광): 인유두종 9G 유전자 칩의 10개 BG 스팟은 배경(background) 형광을 판독하여 교잡반응 후 세척과정에서 발생하는 오류를 판정한다. 배경 형광이 7,000 이상일때 재시험을 알리는 ‘test again' 문구가 Digieye의 Data Analysis Window 상에 나타나게 되며 재시험을 실시한다.

② HC (Hybridization control): 인유두종 9G 유전자 칩의 4개 HC 스팟은 교잡반응용액에 포함되어 있는 HC Cy5-DNA와 결합하며, 교잡반응 시 교잡반응용액의 양을 정확하게 사용하였는지를 판정한다. 또한 세척단계 중 과도한 세척에 따른 판독 오류를 제거하기 위한 판정기준이다. 교잡반응용액이 적게 사용되거나 과도한 세척으로 HC 형광이 50,000 미만으로 판독되면 재시험의 진행을 알리는 ‘test again' 문구가 Digieye의 Data Analysis Window 상에 나타나게 되며 재시험을 실시한다.

③ PC (Positive control): 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩의 2개 PC 스팟은 중합효소연쇄반응 결과물을 교잡반응용액에 정확한 양으로 혼합하였는지를 판정한다. 교잡반응용액에 중합효소연쇄반응 결과물이 적게 혼합되어 PC 스팟의 형광이 10,000 미만으로 판독되면 재시험의 진행을 알리는 ‘test again' 문구가 Digieye의 Data Analysis Window 상에 나타나게 되며 재시험을 실시한다.

④ PCR confirm: 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩의 2개 PCR confirm 스팟은 인유두종 바이러스에 대한 중합효소연쇄반응이 일어났는지를 판정한다. 중합효소연쇄반응이 진행되지 않게 되어 PCR confirm 스팟의 형광이 10,000 미만으로 발현되면 ‘Not Detected' 문구가 Digieye의 Data Analysis Window 상에 나타나게 되어 실시된 시험이 음성임을 판정할 수 있다.

⑤ 유전형 판독용 스팟: 4종의 스팟들(BG, HC, PC, PCR confirm)의 형광값이 모두 주어진 기준을 충족하고, 특정 유전형 판독용 스팟의 형광값이 20,000 이상으로 나타나게 되면 이 유전형에 대하여 양성으로 판정할 수 있다. 20,000미만의 수치인 경우 감염된 유전형이 검출되지 않았다는 ‘Not Detected' 문구가 Digieye의 Data Analysis Window 상에 나타나게 되어 실시된 시험이 음성임을 판정할 수 있다.

4.3 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩 포맷

인유두종 바이러스 9G 유전자 칩은 고위험군인 인유두종 바이러스 유전형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 14종과 저위험군인 인유두종 바이러스 유전형 06, 11, 34, 40, 42 5종이 각각 2개의 스팟으로 스폿팅되어 있다. 그리고 판정을 위한 기준점으로 4개의 HC스팟, 2개의 PC 스팟, 2개의 PCR 스팟, 10개의 BG 스팟으로 구성되어 있다.

유전형별 칩 반응 이미지는 아래 표와 같다.

4.4 결과판독 시 주의사항

① 결과판독 전 형광스캐너를 (주)바이오메트릭스 테크놀로지에서 공급한 표준슬라이드를 사용하여 표준슬라이드의 표준스팟 4의 형광감도가 45,000~56,000가 되도록 설정하여 표준스팟 5의 형광감도가 22,000~27,000 이내의 값을 가지도록 스캐너의 PMT gain을 설정하여 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩 상의 HC가 50,000 이상이 되게 보정하여 사용한다.

② ①과 같은 설정 후 시험한 결과 분석 시 다음과 같은 인유두종 바이러스의 스팟에서 20,000 이상 30,000 미만의 형광이 발현될 수 있다.

- 인유두종 바이러스 유전형 34일 때 인유두종 바이러스 유전형 11

- 인유두종 바이러스 유전형 35일 때 인유두종 바이러스 유전형 51

- 인유두종 바이러스 유전형 66일 때 인유두종 바이러스 유전형 56

4.5 일반적 오류해결

1) 칩 스캔결과에서 칩 배경형광이 지저분하게 나타나는 경우

예시)

① 칩에 나타나는 배경형광은 대부분 용법용량 3.3항의 유전자 칩 교잡반응과정에서 칩에 남아 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 결과물이 완전히 세척되지 못해서 나타나는 결과이므로 교잡반응 후 세척과정을 점검하고 재시험한다.

② 칩의 세척 후 칩 상에 남아 있는 세척용액이 마르기 전에 건조과정인 원심분리 과정을 빨리 진행하여 세척용액이 말라서 생기는 지저분한 배경이 나타나지 않게 한다.

③ 스팟의 모양이 정상적인 원형 형태가 아닌 경우(예: 반원 형태)에는 칩 처리 과정 중에 부주의로 인한 긁힘 현상일 가능성이 있으므로 재시험을 실시하도록 한다.

2) 스캐닝 결과 HC 스팟이 나타나지 않거나 50,000 미만으로 발현되는 경우

예시)

<HC 스팟이 나타나지 않은 경우> <음성판정의 경우>

① HC 스팟이 나타나지 않은 경우에는 용법용량 3.3항의 유전자 칩 교잡반응과정에서 교잡반응 용액(Hybridization Buffer) 내에 HC Cy-5 DNA가 첨가되지 않아서 나타나는 결과일 수 있기 때문에 교잡반응 용액(Hybridization Buffer)을 확인하고 용법용량 3.3항에 따라 중합효소연쇄반응 결과물을 교잡반응 용액과 혼합하는 과정부터 재시험한다.

② HC 스팟이 50,000 미만으로 나타나는 경우에는 용법용량 3.3항의 유전자 칩 교잡반응과정에서 중합효소연쇄반응(PCR) 결과물과 교잡반응 용액(Hybridization Buffer)을 혼합한 교잡반응용액이 50ul를 정확하게 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩 상에 도포했는지 확인하고 용법용량 3.3항에 따라 중합효소연쇄반응 결과물을 교잡반응 용액과 혼합하는 과정부터 재시험한다.

③ 스캐닝 결과 HC 스팟이 나타나지 않거나 50,000 미만으로 발현되는 경우에는 용법용량3.3항의 유전자 칩 교잡반응 후에 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩을 세척하는 과정에서 제공된 유전자 칩 세척용액(Washing Buffer)로 세척했는지 확인하고 용법용량 3.3항에 따라 중합효소연쇄반응(PCR) 결과물을 교잡반응 완충액과 혼합하는 과정부터 재시험한다.

3) 스캐닝 결과 HC 스팟은 50,000 이상으로 발현되었는데 PC 스팟이 나타나지 않거나 10,000 미만으로 나타나는 경우는 재시험을 실시한다.

예시)

<PC 스팟이 나타나지 않은 경우> <음성판정의 경우>

4) 스캐닝 결과 유전형 판정 스팟은 20,000 이상으로 발현되었으나 PCR confirm 스팟이 10,000 미만으로 나타나는 경우는 재시험을 실시한다.

5) 스캐닝 결과 PCR confirm 스팟이 10,000 이상으로 발현되었으나 19종의 유전형 판정 스팟에서 20,000 미만으로 발현되는 경우 인유두종 바이러스 9G 유전자 키트에서 검출 가능한 19종 인유두종 바이러스 이외의 다른 인유두종 바이러스일 수 있다.

6) 스캐닝 결과 여러 개의 인유두종 바이러스 특이 스팟이 나타나는 경우

① 여러 개의 인유두종 바이러스 특이 스팟이 동시에 나타나는 경우에는 중합효소연쇄반응 과정에서 다른 검체와의 오염유무를 확인하여야 하며 반복 검사에서도 동일한 결과가 나올 경우 다중 감염으로 판정한다.

② 만약 다른 방법으로 음성이 확인된 검체가 양성으로 판정되면 유전자 추출 과정이나 중합효소연쇄반응 과정에서 오염을 체크한다.

③ 음성샘플에 양성으로 시그널이 나타날 경우, 중합효소연쇄반응 시약의 오염을 의심할 수 있으며, 이때는 모든 중합효소연쇄반응 시약을 바꾸어 재시험한다. 또한 중합효소연쇄반응 과정과 전기영동, 교잡반응에 사용하는 피펫을 구분하여 사용한다.

④ 검사 과정에서 항상 일회용 비닐장갑이나 라텍스 장갑을 착용하고, 시약의 분주 시에 오염을 주의한다.

⑤ 매 검사 과정 시 피펫과 주위 환경을 70% 알코올과 유전자 제거용액으로 닦고 청결히 한다.

⑥ 중합효소연쇄반응 시의 오염을 방지하기 위해서 프라이머는 분주하여 사용한다.

⑦ 매 검사 시 사용하는 증류수는 항상 새로운 것을 사용하여 오염을 방지한다.

⑧ 교잡반응 전 커버웰이 칩과 잘 부착되었는지 확인한다.

⑨ 칩에 중합효소연쇄반응 결과물 주입 시에 다른 커버웰에 중합효소연쇄반응 결과물이 튀어 들어가지 않게 주의한다.

① 검사 시 양성대조액와 음성샘플을 동시에 검사하여야 한다.

② 양성대조액으로 시험하였을 때 각각의 스팟감도는 HC는 50,000 이상, PC와 PCR confirm 은 10,000 이상이어야 하며 인유두종 바이러스 유전형 16 스팟에서만 20,000 이상이고 그 외 유전형 스팟에서는 20,000 미만이어야 한다.

③ 음성샘플로 시험하였을 때 각각의 스팟감도는 HC는 50,000 이상, PC는 10,000 이상, PCR confirm은 10,000 미만, 그리고 인유두종 바이러스 유전형 스팟에서는 모두 20,000 미만이어야 한다.

④ 인유두종 바이러스 9G 유전자 칩 성능검사 결과가 정도관리 ②와 ③의 판정기준을 통과하지 못하면 재시험을 실시한다.

저장방법