굿젠 성전염성 질환 유전자형 분석 DNA 마이크로 어레이 (GG STD DNA CHIP) - 의약품 상세정보

남성 소변, 성기궤양 스왑 또는 여성 질 스왑 가검물로부터 추출한 총 디엔에이(total DNA) 농도는 10 - 150 ng/㎕이어야 하며, 순도는 A260/A280 비율이 1.5 이상인 검체를 사용한다. 추출된 DNA 검체는 검사 후 즉시 폐기한다.

냉동보관 되어진 시약은 검사직전에 4℃에서 서서히 해동하여 4℃를 유지한다.

※ 교잡반응용액 및 세척완충용액 시약들은 동일 STD DNA chip 키트내에 완전 사용하고 남은 시약들은 반드시 폐기한다.

1) 전체적인 개요

(1) Genomic DNA 추출 키트를 이용하여 가검물로부터 게놈 DNA를 추출한다.

(2) 추출한 게놈 DNA를 STD에 특이적인 프라이머 세트 (A1 프라이머, A2 프라이머, B1 프라이머, B2 프라이머)와 PCR 프리믹스를 가지고 중합 효소 연쇄반응 (PCR)을 하여 표적 DNA를 증폭한다.

(3) 적절한 조건에서 증폭된 DNA를 굿젠 올리고 칩 슬라이드(STD DNA CHIP)에서 교잡 반응을 수행한다.

(4) GenePix 4000B (Axon, USA) 또는 EasyScan-1 (Nanostorage, Korea)를 이용하여 스캔한다.

2) 중합효소연쇄반응 과정(PCR)

가. 검사전 준비

(1) 본 키트에서 제공하지 않지만 필요한 시약 및 기자재

- Cy5-dCTP (25 nmol, GE Health Care, USA (cat#. PA55021); 1mM, 진캠(주), Korea (cat#. GCCD0016))는 50 pmol/㎕로 희석하여 사용한다., PCR 기기(ABI2720, ABI, USA;. T3, Biometra Inc. Germany)는 그 기기의 작동법에 따라 작동한다. 멸균된 3차 증류수를 준비한다.

(2) 프리믹스의 경우, 보관 중 튜브 벽면에 서리가 생길 수 있다. 이때 6,000 ×g에서 30 초간 원심 분리하여 프리믹스 시약을 튜브 바닥에 모은 다음 사용한다.

(3) 정제수에 녹여져 있는 프라이머는 -20 ℃에 보관하여 3 개월간 유효하며, 적정량을 분주하여 사용하는 것이 바람직하다. 냉동과 해동을 자주할 경우, 프라이머에 자체 손상으로 신호 세기가 약해질 수 있다.

나. 검사 방법

각 반응 튜브의 조성은 다음과 같다.

<예시. 반응 1개 기준 PCR 반응용액 제조>

* Cy5-dCTP는 별도 구매품임

- A1/A2와 B1/B2의 PCR 조성은 위와 동일하다

(1) 한 검체 당 2개씩 프라이머 (A1, A2 및 B1, B2)와 프리믹스를 얼음 위에 준비한다.

(2) 프라이머 A1, A2 및 B1, B2 각각 혼합하기 위한 혼합용 튜브 2개를 준비한다.

(3) 1.5 ㎖ 프리믹스용 튜브에 필요한 양의 정제수를 각각 넣는다.

(4) 각 혼합용 튜브에 필요한 개수에 해당하는 프라이머 세트(A1과 A2 세트, B1과 B2 세트)를 첨가하여 잘 섞는다.

(5) 위 과정에서 준비한 A과 B 프라이머 혼합액을 각각의 프리믹스 튜브에 각각 10 ㎕씩 분주한다.

(6) 프라이머가 첨가된 프리믹스 튜브에 주형 DNA (게놈 DNA)를 각각 5 ㎕를 첨가한 후, 잘 섞어준다.

(7) 각 혼합액 튜브는 간략하게 원심분리 후, PCR 장치(ABI 2720, USA; T3 Biometra Inc. Germany)에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.

다. STD 증폭 DNA의 확인과정(선택 사항)

3 % 한천 젤을 이용하여 증폭된 DNA 5 ㎕를 전기영동으로 확인 가능하다. 전기영동 전압 200 volt로 약 30 분간 수행하여 STD의 A type - NG는 284bp, MH는 333bp, UU는 373bp, MG는 207 bp, 그리고 TV는 262bp이고, B type CT는 321 bp, HSV1은 384bp HSV2는 400bp, TP는 260bp 길이의 PCR 증폭산물을 확인 할 수 있다. 전기영동시 사이즈 마커로는 100 bp ladder를 이용한다.

< 증폭된 STD DNA의 전기영동 결과 예 >

3) 교잡 반응 과정

가. 검사 전 준비

(1) 반응할 PCR산물을 변성시킬 수 있는 95 ℃의 Heat block을 준비한다.

(2) 칩 반응 시에 사용할 52 ℃의 반응조 (Combi-SV12, Fine PCR Inc., USA)를 준비한다. 반응조는 반응 시에 습기가 유지될 수 있도록 물기를 머금은 티슈를 반응조의 가장자리에 놓는다.

(3) 미리 준비한 세척용액은 밀폐용기에 보관한다.

(4) 세척을 할 수 있는 정방형 용기나 50 ㎖ 반응용 튜브를 준비한다.

(5) 세척 용액의 준비

① 세척용액 1: 5 ㎖의 세척완충용액1 (S1 buffer), 2 ㎖의 세척완충용액2 (S2 buffer)을 993 ㎖의 증류수와 잘 혼합한다.

② 세척용액 2: 3 ㎖의 세척완충용액1 (S1 buffer)을 997 ㎖의 증류수와 잘 혼합한다.

※ 사용 직전에 제조하며 사용 후에 폐기한다.

나. 교잡 반응

(1) 반응할 검체 수만큼 새로운 1.5 ㎖ 혹은 200 ㎕ 용량의 튜브를 준비한다.

(2) 위 튜브에 44 ㎕씩 정제수를 분주한다.

(3) STD 증폭(PCR) 산물 중 A와 B는 10 ㎕씩 첨가하고, Cy5-HBB 올리고는 1 ㎕를 첨가하여 잘 섞는다.

(4) 위 튜브를 95 ℃로 준비한 Heat block에 3분간 방치한다.

(5) 위 튜브를 바로 얼음에서 5 분간 방치한다.

(6) 반응 튜브를 원심분리기를 이용하여 30 초간 원심분리하여 용액을 떨군다.

(7) 위 튜브에 교잡반응 용액 (HYB1 buffer)을 65 ㎕를 첨가하여 피펫으로 잘 섞어 준다.

(8) 준비한 반응용액을 칩 표면에 부착된 커버 슬립 위에 있는 주입구(구멍)에 천천히 주입한다.

- 이때 칩과 반응 커버웰 사이에 기포가 있는지 부착이 잘 되어있는지를 확인한다. 혹시 기포가 있다면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어 내어 기포를 제거한다.

(9) 52 ℃ 반응조에서 30 분간 칩을 교잡 반응시킨다.

다. 반응 후 세척

(1) 교잡 반응이 끝나면, 칩에서 커버웰을 제거한다.

(2) 미리 준비한 세척 용액 1을 세척용 용기에 반응할 칩이 잠길 수 있게 붓고 반응한 칩을 수평왕복교반기를 이용하여 실온에서 2 분간, 8 Oscillation의 속도로 세척한다.

- 만약 반응 칩이 1 개라면, 50 ㎖ 원추형 튜브에 40 ㎖의 세척 용액을 넣고 반응한 칩을 넣은 후, 상하로 2 분간, 분당 50 회의 속도로 흔들어 세척할 수 있다.

- 수평왕복교반기를 이용하지 않고 수동으로 세척할 경우 세척용기에 세척용액을 반응한 칩이 잠길 수 있게 붓고, 실험대에서 손으로 좌우로 2 분간 분당 50회의 속도로 세척용기를 흔들어 세척 한다.

(3) 사용한 세척 용액을 버리고 다시 세척 용액 1를 넣고 2 분간씩 2회 세척한다.

(4) 사용한 세척 용액을 버리고 다시 세척 용액 2를 넣고 2 분간 세척한다.

(5) 세척 후에도 칩에 남은 버퍼 습기를 제거하기 위해 반응부위를 제외한 부분에 스핀 드라이기나 공기 컴프레서를 사용할 수 있다. (간단히 킴와이프 종이로 살짝 덮어 칩에 묻어 있는 버퍼를 제거할 수 있다. 단, 손으로 반응부위를 만져서는 절대 안 된다.)

[1] GenePix 4000B Scanner를 사용할 경우

GenePix 4000B scanner를 사용할 경우 아래의 기기 제조사의 방법에 따라 스캔 (scan) 한다.

1) 스캐너의 전원 공급 장치의 전원을 켠다.

2) 윈도우 화면상의 GenePix Pro6.0 아이콘을 작동시킨다.

3) Hard ware diagnostics( 아이콘)창을 활성화시켜, 파장 635에 Laser power 100, PMT800, Pix size 10 ㎛, Lines to average 1, Focus Position 0 ㎛로 세팅한다.

4) 스캐너 문을 살며시 열어 칩의 스티커 부분이 아래로, 반응된 면이 아래로 향하게 하여 장착한다.

5) "Preview scan"  아이콘을 작동하여 스캐닝 하고자 하는 위치의 스캐닝 영역을 조절한다.

6) "Data scan" 아이콘을 실행하여 발색된 시그널을 확인한다.

7) 스캔된 이미지상에서 반응한 부위만 그리드 아이콘 을 실행하여 컬럼 x Row 6x8, 컬럼& Row spacing 375 ㎛, Feature diameter 100 ㎛를 설정한다. 그리드의 이동 시에는 아이콘 을 사용하여 스팟이 있는 부위에 정확하게 그리드를 맞춘다.

8) "Align features in All Blocks" 아이콘 을 실행한다.

9) "Analyze" 아이콘 을 실행한 후, "Results"를 grs 파일 형태로 저장 아이콘 을 실행시켜 저장 한다.

10) 저장된 grs 파일 결과를 엑셀프로그램에서 불러와, SBR(각 점작 영상의 화소와 화소를 둘러싼 배경 영상의 화소값 비, Signal-to-Background Gray level Ratio)값을 수식 "F635 Median÷B635 Median"으로 계산하여 구한다. 영상분석에 대한 알고리즘은 별첨 9에 첨부하였다.

11) STD 유전형 마다 2개 스팟에 대한 SBR 값을 구한다.

12) HBB의 경우 6개 스팟에 대한 SBR값을 구한다.

13) STD 9종의 28개 스팟에 대한 SBR값 (=F635 Median/B635 Median)을 가지고 결과를 판정한다.

14) 스캐너 사양

[2] Easy Scan-1 Scanner를 사용할 경우

Easy Scan-1 scanner를 사용할 경우 아래의 기기 제조사의 방법에 따라 스캔 (scan) 한다.

1) 스캐너의 전원 공급장치의 전원을 켠다.

2) 윈도우 화면상의 EasyScan을 작동시킨다.

<스캐너 동작 초기화면>

3) 스캐너 문을 살며시 열어 칩의 스티커 부분이 위로, 반응된 면이 위로 향하게 하여 장착한다.

<스캐너에 슬라이드 장착하는 모습>

4) 다음 슬라이드의 장착은 버턴을 눌러서 스캐너의 슬라이드 고정판을 회전 시킨 후 다음 그림과 같이 장착한다.

<스캐너에 다음 번 칩을 장착하기 위한 모습>

스캐너에 칩을 장착하고 스캐너 옆면의 하얀 버튼을 눌러 다음 번 칩 holder가 나오도록 조정한 다음 칩을 상기 그림과 동일하게 장착한다.

5) “Scan” icon을 눌러서 스캔을 시작한다. 진행상황은 시간으로 표시된다.

6) 스캔 완료 후 NanoDscan 을 실행시킨다.

7) “Load Images” 클릭하며, 저장된 이미지를 불러온다. (*.TIF)

8) “Loda Gene ID”를 클릭하여, BlockRow : 4 BlockCol : 2 를 입력한다.

9) “Load GeneID File”을 클릭하여 “GoodGene STD(6X8)” file을 선택한다.

10) 각 검체의 ID를 입력한다. (슬라이드 Hole 번호 참조)

11) 불러온 이미지 파일을 두번 클릭한다.

12) “IMAGE CONTROL” 메뉴의 “Auto Level” 및 Icon 을 클릭하여, 화면의 밝기를 조절한다.

13)  을 이용하여, 슬라이드의 크기를 조절한다.

14) “Load Tmp”를 클릭하여, “GoodGene STD(6X8).tpl” 파일을 선택한다.

15) “Move Block Range” 선택 하여, 그리드를 Chip image에 맞게 이동한다. (HBB Spot (Backbone)위치 활용)

16) “Spot Finding”을 클릭하여, 발현된 Spot의 이미지를 찾는다.

17) “Quantification” 을 클릭하여 Finding 된 Spot의 signal 값을 계산한다.

18) “Save Results”를 클릭하여 분석된 값을 저장한다.

19) “Make Report”를 클릭하여 작성된 검체의 보고서를 확인한다.

20) 스캐너 사양

가. 양성 판정

모든 HBB 6개 스팟 SBR값이 2.5 이상이며, 해당 STD 유전형 2개의 스팟 모두 SBR값이 2.5 이상일 경우, 해당 STD 유전형을 결정한다. 본 STD DNA chip의 경우 HSV2에 감염된 검체는 HSV1에 약한 교차반응이 나타나므로 HSV1의 교차반응이 일어나는 HSV2의 경우 HSV2 양성으로 판정한다.

나. 음성 판정

모든 HBB 6개 스팟 SBR값이 2.5 이상이며, 9종의 STD 유전형의 SBR값이 모두 2.5 미만일 경우, 본 제품에서 검출이 가능한 9가지 STD에 대하여 해당 검체를 음성으로 판단한다.

다. 재시험

① 모든 HBB 스팟 6 개가 SBR 2.5가 넘지 않을 경우, 교잡반응부터 재시험한다.

② HBB 스팟 6 개중 1 개라도 SBR이 2.5가 넘지 않을 경우, 교잡반응부터 재시험한다.

③ STD 유전형 9 종(동일 유전형 1개 당 2 or 4 스팟)의 28개 스팟에서, 동일 유전형 스팟 2 개중에 1 개라도 SBR값이 2.5 이상 또는 미만일 경우, 검체의 검사부터 재시험한다.

< SBR 결과 판독기준 정리>

라. STD 유전자형 결정

다음의 결과 분석표를 참조하여 STD 유전자형을 결정한다.

① 아래의 그림과 같이 NG (Neissetia gonorrhoeae), CT (Chlamydia trachomatis), MH (Mycoplasma hominis), UU (Ureaplasma urealyticum), MG (Mycoplasma genitalium), TV (Trichomonas vaginalis)와 HSV(Herpes simplex virus) 1, HSV 2, TP (Treponema pallidum)의 각 유전형에 대해서 2개의 스팟 씩 배열되어 있다.

② HBB 스팟은 각 STD 유전형을 알아보기 위해 코너 마커로서 다음의 그림에서 보는 바와 같이 배열되어 있다.

마. 판독 예

1) 분류

*요도염 원인군 : NG, CT, MH, UU, MG, TV

*성기궤양 원인군 : HSV-1, HSV-2, TP

2) 판독 예시

가. 스팟의 직경 및 균일도

집적된 스팟의 품질 관리 (스팟 직경과 프로브의 균일 농도)를 위하여, 양성대조액 A, B로 PCR 반응, 칩 교잡반응 후, 이를 Axon Scanner 635 nm에서 스캔하여 스팟의 직경과 SBR값을 측정하여 전체 스팟 중 빈 스팟 자리를 제외한 34개의 스팟의 직경 및 SBR값은 스팟의 직경 180 ± 30 ㎛, SBR 2.5 이상이면, 칩 스팟은 적합으로 판단한다.

나. 양성대조액/음성대조액 칩 반응

양성대조액 A, B와 음성 대조액을 이용하여 아래와 같이 칩 반응 한 후 SBR값을 확인하여 각 표준물질 (양성 대조액 A의 경우 NG, MH, UU, MG, TV의 스팟에서만 검출되어야 하고, 양성 대조액 B의 경우 CT, HSV1, HSV2, TP의 스팟에서만 검출되어야 한다)에 해당하는 스팟의 SBR값이 2.5이상이고 교차반응성이 없는지를 확인한다.

① A set PCR 조성 및 조건:

* PCR 조건: 40 cycles이며, Annealing temp. 58도.

* Cy5-dCTP는 별도 구매품임

② B set PCR 조성 및 조건:

* PCR 조건: 40 cycles이며, Annealing temp. 58도.

* Cy5-dCTP는 별도 구매품임

③ 음성대조액 PCR 조성 및 조건

* PCR 조건: 40 cycles이며, Annealing temp. 58도.

* Cy5-dCTP는 별도 구매품임

④ 칩 반응 조성

포장단위

저장방법 및 사용기간