몰레큐텍 레바 마이코-아이디(수출용)(수출명 : MolecuTech REBA Myco-ID) - 의약품 상세정보

(1) 검체

① 사람의 객담, 기관지 세척액, 체액, 조직, 배양검체

② DNA 추출물

(2) 검체의 준비 방법

① 객담 : 4% NaOH로 처리한 후, 원심 분리하여 상층을 제거하고 침전물을 사용한다.

② 기관지 세척액, 체액 : 원심 분리하여 침전물을 생리식염수나 인산염 완충액으로 녹여 냉장에 보관하며 사용한다.

③ 조직 : DNA를 추출하기 전 파라핀블록에 고정된 검체를 준비해 둔다.

④ 배양검체 : DNA를 추출하기 전 배양기로부터 배양된 검체를 꺼내어 준비한다.

(3) 보관

① 객담, 기관지 세척액, 체액 : 검체를 채취한 즉시 DNA를 추출하되, 그렇지 못할 경우 반드시 냉장 보관한다.

② 조직 : 파라핀 블록에 고정된 상태로 실온에 보관한다.

(1) DNA 추출

1) 객담, 기관지 세척액, 체액

① 50 ㎖ tube에 검체(객담, 기관지 세척액 또는 체액)를 3 ㎖이상 취한다.

② 객담과 동량의 4% NaOH를 넣고, 1분간 vortex한 후 실온에서 15-20분 방치한다.

③ PBS(pH7.2)로 40㎖ 첨가 후 4,300rpm, 30분간 원심 분리 후, 상층액을 제거한다.

④ Pellet을 vortex후, 1.5 ㎖ tube로 옮긴다.

⑤ 멸균된 증류수로 약 1.2 ㎖ 까지 채우고 vortex후, 13,000 rpm에서 5분동안(4℃) 원심분리한다.

⑥ 상층액은 micropipette을 이용하여 완전히 제거한다.

⑦ 위 ⑤,⑥ 두 과정을 1회 반복한다.

⑧ DNA 추출 용액 50 ㎕를 넣고, 1분간 vortex한다.

⑨ Heating block에서 100℃에서 10분간 끓인 후, 원심분리(13,000 rpm, 3분, 실온)한다.

⑩ 상층액 3~5 ㎕를 주형 DNA로 사용하여 (2)번의 PCR을 수행한다.

⑪ 기관지 세척액과 체액의 경우 검사실마다 채취방법이 다를 수 있으나, 최소 3 ㎖이상을 취하도록 권장한다.

2) 조직

① 조직검체에 xylene을 1,200 ㎕ 넣고, 파라핀 블록이 완전히 녹을 때까지(파라핀 조각이 없을 때 까지) 강하게 vortex 한 후, 실온, 13,000 rpm에서 4분간 원심분리 한다.

② 상층액을 마이크로파이펫을 이용하여 완전히 제거한다.

③ 100% 에탄올을 1,200 ㎕ 넣고, 약하게 vortex하여 섞은 후, 실온, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층의 에탄올을 제거한다.

④ ③과정을 1회 반복한다.

⑤ 에탄올을 깨끗이 제거하기 위해, 튜브의 뚜껑을 열고 건조 (37℃, 약 10~15분) 한다.

⑥ DNA 추출용액 50 ㎕를 넣고, 1분간 vortex 한다.

⑦ Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

⑧ 상층액 3~5 ㎕를 취해 PCR을 수행한다.

3) 배양검체

① 고체배지에서 배양한 균의 경우는 멸균 loop로 1 loop (직경 0.2 ㎛)를 떼어낸 후 준비된 DNA 추출용액의 레진이 골고루 퍼지게 잘 흔들어 준 후 50 ㎛를 넣고, 1분간 vortex하여 잘 풀어준다.

② 이 튜브를 Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

③ 액체배지에서 배양한 균의 경우는 액체배양균을 튜브에 1 ㎖을 취한다. 실온에서 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 상층액을 완전히 제거 한다. 세척을 위하여 튜브에 멸균된 증류수 1 ㎖ 에 채운 후 균액을 잘 풀어 vortex 한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 마이크로파이펫을 이용하여 완전히 제거한다. 멸균된 증류수 세척을 1회 더 반복한다. 세척이 완료된 집균된 균에 DNA 추출용액의 레진이 골고루 퍼지게 잘 흔들어 준 후 50 ㎛를 넣고, 1분간 vortex하여 잘 풀어준다.

④ 이 튜브를 Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

⑤ 상층액 3~5 ㎕를 취해 PCR을 수행한다.

(2) PCR

① 아래의 시약들을 제공된 PCR프리믹스가 들어있는 PCR 튜브에 넣어 PCR mixture를 만든다.

② 미리 94℃로 예열된 PCR기기에 ①에서 준비한 튜브를 넣는다.

③ 아래의 프로그램으로 PCR 반응을 즉시 수행한다.

(3) Reverse Blot Hybridization Assay (REBA)

① PCR 산물 15㎕와 변성 시액(DS) 15㎕ (1:1 비율)을 1.5 ㎖ eppendorf 튜브에 넣고 섞는다.

② 튜브를 tapping 또는 약하게 vortex 한 후 quick-spin하고 25℃에서 5분간 방치하여 PCR산물을 변성시킨다.

③ 반응이 진행되는 동안, 검사에 필요한 수만큼 멤브레인을 제공된 blotting tray의 각 well에 놓고 교잡 시액(HS) 500 ㎕을 각 well에 분주한다.

④ 변성이 끝난 ②번 혼합액에 교잡 시액(HS) 470 ㎕를 각각 넣고 3-4회 pipetting하여 잘 섞은 후 한 검체당 한 멤브레인에 골고루 뿌린다.

⑤ 멤브레인이 들어있는 blotting tray를 55℃ 항온수조에 두고, 60~80 rpm으로 30분 동안 반응시켜 혼성화 한다.

⑥ 혼성화 반응이 진행되는 동안 세척액(WS)을 55℃ 항온 수조에 넣어 미리 데워 놓는다.

⑦ 각 well로부터 hybridization mixture를 aspirator로 완전히 제거한다.

⑧ 미리 데워 놓은 세척액(WS)을 각 well에 1 ㎖씩 분주하고, blotting tray를 55℃ 항온수조에서 60~80 rpm으로 10분간 두어 세척한다.

⑨ 세척이 끝난 tray의 각 well에서 세척액(WS)을 제거한 후 ⑧의 세척과정을 1회 더 반복한다.

⑩ 두 번째 세척이 완료되기 전에 에이피 콘쥬게이트를 콘쥬게이트 희석액(CDS)으로 1:2500 배로 희석하여 준비한다. (스트립 1개당 콘쥬게이트 희석액(CDS) 1 ㎖에 에이피콘쥬게이트 0.4 ㎕를 혼합하여 희석한다.)

⑪ 세척액(WS)을 aspirator로 완전히 제거하고 각 well에 미리 희석한 에이피 콘쥬게이트용액을 1 ㎖씩 분주하고 Dancer (Shaker)로 25℃에서 60~80 rpm으로 30분 동안 반응시킨다.

⑫ 콘쥬게이트 반응이 완료되면, 반응액을 제거한다.

⑬ 각 well에 콘쥬게이트 희석액(CDS) 1 ㎖씩 분주하고 Dancer (Shaker)로 25℃에서 1분씩 2회 반복하여 세척한다.

(4) 발색반응

① (3)-⑬번 반응이 끝나기 전에 엔비티/비씨아이피 농축액을 발색제 희석액(SS)에 1:100 배로 희석한다.(스트립 1개당 발색제희석액(SS) 1 ㎖ 에 엔비티/비씨아이피 농축액 10 ㎕를 혼합하여 희석한다.)

② (3)-⑬번 반응이 끝나고 각 well의 콘쥬게이트 희석액(CDS)를 각 aspirator로 완전히 제거한다.

③ 미리 희석하여 준비해 놓은 엔비티/비씨아이피/발색제 희석액(SS)을 각 well에 1㎖씩 분주한 후, 25℃에서 5분 또는 Band의 색이 잘 나올 때 (10분)까지 stain한 후, aspirator로 완전히 제거한다.

④ 증류수로 2회 세척한 후, 완전히 건조하여 판독한다.

(1) 음성 : 아래 그림의 1번 스트립처럼 HC (Hybridization Control) 라인만 발색한 경우 음성으로 판정한다.

(2) 양성 : HC와 Myc 라인이 발색한 경우, Mycobacterium 양성이며 다음과 같이 판정한다.

① 아래 그림의 2번 스트립처럼 HC, Myc 라인만 발색한 경우에는 결핵균(MTB complex) 및 아래의 19종의 비결핵마이코박테리아 (Non-Tuberculous Mycobacteria : NTM) 이외의 다른 Mycobacterium 종 양성으로 판정한다.

② 아래 그림의 3번 스트립처럼 HC, Myc 라인과 MTB complex 라인이 발색한 경우 결핵균(MTB complex : Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. canetti, M. microti) 양성으로 판정한다.

③ 아래 그림의 4~19번 스트립처럼 HC, Myc 라인과 해당 비결핵마이코박테리아 (Non-Tuberculous Mycobacteria : NTM)의 라인이 발색한 경우 19종의 NTM 해당 균주(M. avium, M. intracellulare ,M. scrofulaceum, M. abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. fortuitumcomplex, M.ulcerans, M. marinum, M. kansasii, M. genavense, M. simiae, M.terrae, M. nonchromogenicum, M. celatum, M. gordonae, M. szulgai, M. mucogenicum, M. aubagnense) 양성으로 판정한다.

(3) 재시험 : HC라인이 발색하지 않은 경우 재시험을 실시한다.

(1) HC (Hybridization Control) : HC 라인은 모든 검체에서 발색하여야 한다.

(2) 음성대조액 (멸균증류수 사용) : HC 라인만 발색 하여야 한다.

(3) 양성대조액 : HC, Myc, MTB complex의 3개의 라인이 발색하여야 한다.

(1) PCR 프리믹스

(2) 양성 대조액

(3) DNA추출용액

(4) 8-몹(MOP)

(1) 마이코-아이디 프라이머믹스Ⅰ

(2) 마이코-아이디 프라이머믹스Ⅱ

(3) 에이피 콘쥬게이트

(4) 엔비티/비씨아이피 농축액

(5) 변성시액(DS)

(1) 멤브레인

(2) 교잡시액(HS)

(3) 세척액(WS)

(4) 콘쥬게이트 희석액(CDS)

(5) 발색제 희석액(SS)

(6) 멤브레인 트레이