몰레큐텍 레바 엠티비-엠디알(수출용)(수출명:MolecuTech REBA MTB-MDR) - 의약품 상세정보

(1) 검체

① 사람의 객담, 기관지 세척액, 체액, 조직, 배양검체

② DNA 추출물

(2) 검체의 준비 방법

① 객담 : 4% NaOH로 처리한 후, 원심 분리하여 상층을 제거하고 침전물을 사용한다.

② 기관지 세척액, 체액 : 원심 분리하여 침전물을 생리식염수나 인산염 완충액으로 녹여 냉장에 보관하며 사용한다.

③ 조직 : DNA를 추출하기 전 파라핀블록에 고정된 검체를 준비해 둔다.

④ 배양검체 : DNA를 추출하기 전 배양기로부터 배양된 검체를 꺼내어 준비한다.

(3) 보관

① 객담, 기관지 세척액, 체액 : 검체를 채취한 즉시 DNA를 추출하되, 그렇지 못할 경우 반드시 냉장 보관한다.

② 조직 : 파라핀 블록에 고정된 상태로 실온에 보관한다.

(1) DNA 추출

1) 객담, 기관지 세척액, 체액

① 50 ㎖ 튜브에 검체(객담, 기관지 세척액 또는 체액)를 3 ㎖이상 취한다.

② 객담과 동량의 4% NaOH를 넣고, 1분간 vortex한 후 실온에서 15-20분 방치한다.

③ PBS(pH7.2)로 40㎖ 첨가 후 4,300rpm, 30분간 원심 분리 후, 상층액을 제거한다.

④ Pellet을 vortex후, 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴다.

⑤ 멸균된 증류수로 약 1.2 ㎖ 까지 채우고 vortex후, 13,000 rpm에서 5분동안(4℃) 원심분리한다.

⑥ 상층액은 마이크로파이펫을 이용하여 완전히 제거한다.

⑦ 위 ⑤,⑥ 두 과정을 1회 반복한다.

⑧ DNA 추출 용액 50 ㎕를 넣고, 1분간 vortex한다.

⑨ Heating block에서 100℃에서 10분간 끓인 후, 원심분리(13,000rpm, 3분, 실온)한다.

⑩ 상층액 5~10 ㎕를 주형 DNA로 사용하여 (2)번의 PCR을 수행한다.

⑪ 기관지 세척액과 체액의 경우 검사실마다 채취방법이 다를 수 있으나, 최소 3 ㎖이상을 취하도록 권장한다.

2) 조직

① 조직검체에 xylene을 1,200 ㎕ 넣고, 파라핀 블록이 완전히 녹을 때까지(파라핀 조각이 없을 때 까지) 강하게 vortex 한 후, 실온, 13,000 rpm에서 4분간 원심분리 한다.

② 상층액을 마이크로파이펫을 이용하여 완전히 제거한다.

③ 100% 에탄올을 1,200 ㎕ 넣고, 약하게 vortex하여 섞은 후, 실온, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층의 에탄올을 제거한다.

④ ③과정을 1회 반복한다.

⑤ 에탄올을 깨끗이 제거하기 위해, 튜브의 뚜껑을 열고 건조 (37℃, 약 10~15분) 한다.

⑥ DNA 추출용액 50 ㎕를 넣고, 1분간 vortex 한다.

⑦ Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

⑧ 상층액 5~10 ㎕를 취해 PCR을 수행한다.

3) 배양검체

① 고체배지에서 배양한 균의 경우는 멸균 loop로 1 loop (직경 0.2 ㎛)를 떼어낸 후 준비된 DNA 추출용액의 레진이 골고루 퍼지게 잘 흔들어 준 후 50 ㎛를 넣고, 1분간 vortex하여 잘 풀어준다.

② 이 튜브를 Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

③ 액체배지에서 배양한 균의 경우는 액체배양균을 튜브에 1 ㎖을 취한다. 실온에서 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 상층액을 완전히 제거 한다. 세척을 위하여 튜브에 멸균된 증류수 1 ㎖ 에 채운 후 균액을 잘 풀어 vortex 한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 마이크로파이펫을 이용하여 완전히 제거한다. 멸균된 증류수 세척을 1회 더 반복한다. 세척이 완료된 집균된 균에 DNA 추출용액의 레진이 골고루 퍼지게 잘 흔들어 준 후 50 ㎛를 넣고, 1분간 vortex하여 잘 풀어준다.

④ 이 튜브를 Heating block에서 100℃, 10분간 가열한 후, 실온에서 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.

⑤ 상층액 3~5 ㎕를 취해 PCR을 수행한다

(2) PCR

① 아래의 시약들을 제공된 PCR프리믹스가 들어있는 PCR 튜브에 넣어 PCR mixture를 만든다.

② 미리 94℃로 예열된 PCR기기에 ①에서 준비한 튜브를 넣는다.

③ 아래의 프로그램으로 PCR 반응을 즉시 수행한다.

(3) Reverse Blot Hybridization Assay (REBA)

① PCR 산물 45 ㎕와 변성 시액(DS) 45 ㎕ (1:1 비율)을 1.5 ㎖ eppendorf 튜브에 넣고 섞는다.

② 튜브를 tapping 또는 약하게 vortex 한 후 quick-spin하고 25℃에서 5분간 방치하여 PCR산물을 변성시킨다.

③ 반응이 진행되는 동안, 검사에 필요한 수만큼 멤브레인을 제공된 blotting tray의 각 well에 놓고 교잡 시액(HS) 500 ㎕을 각 well에 분주한다.

④ 변성이 끝난 ②번 혼합액에 교잡 시액(HS) 410 ㎕를 각각 넣고 3-4회 pipetting하여 잘 섞은 후 한 검체당 한 멤브레인에 골고루 뿌린다.

⑤ 멤브레인이 들어있는 blotting tray를 50℃ 항온수조에 두고, 60~80 rpm으로 30분 동안 반응시켜 혼성화 한다.

⑥ 혼성화 반응이 진행되는 동안 세척액(WS)을 63℃ 항온 수조에 넣어 미리 데워 놓는다.

⑦ 각 well로부터 hybridization mixture를 aspirator로 완전히 제거한다.

⑧ 미리 데워 놓은 세척액(WS)을 각 well에 1 ㎖씩 분주하고, blotting tray를 63℃ 항온수조에서 60~80 rpm으로 10분간 두어 세척한다.

⑨ 세척이 끝난 tray의 각 well에서 세척액(WS)을 제거한 후 ⑧의 세척과정을 1회 더 반복한다.

⑩ 두 번째 세척이 완료되기 전에 에이피 콘쥬게이트를 콘쥬게이트 희석액(CDS)으로 1:2500 배로 희석하여 준비한다.(스트립 1 개당 콘쥬게이트 희석액(CDS) 1 ㎖에 에이피 콘쥬게이트 0.4 ㎕를 혼합하여 희석한다.)

⑪ 세척액(WS)을 aspirator로 제거하고 각 well에 미리 희석한 에이피 콘쥬게이트용액을 1㎖씩 분주하고 Dancer (Shaker)로 25℃에서 60~80 rpm으로 30분 동안 반응시킨다.

⑫ 콘쥬게이트 반응이 완료되면, 반응액을 제거한다.

⑬ 각 well에 콘쥬게이트 희석액(CDS) 1㎖씩 분주하고 Dancer (Shaker)로 25℃에서 1분씩 2회 반복하여 세척한다.

(4) 발색반응

① (3)-⑬번 반응이 끝나기 전에 엔비티/비씨아이피농축액을 발색제 희석액(SS)에 1:50 배로 희석한다.(스트립 1개당 발색제 희석액(SS) 1 ㎖에 엔비티/비씨아이피 농축액 20 ㎕를 혼합하여 희석한다.)

② (3)-⑬번 반응이 끝나고 각 well의 콘쥬게이트 희석액(CDS)를 각 aspirator로 완전히 제거한다.

③ 미리 희석하여 준비해 놓은 엔비티/비씨아이피/발색제 희석액(SS)을 각 well에 1㎖씩 분주한 후, 25℃에서 10분 또는 Band의 색이 잘 나올 때 (20분)까지 stain한 후, aspirator로 완전히 제거한다.

④ 증류수로 2회 세척한 후, 완전히 건조하여 판독한다.

(1) 음성 : HC (Hybridization Control) 라인만 발색한 경우 음성으로 판정한다.

(2) 양성 : HC, Myc, MTB complex 라인이 발색하여야 한다.

① 리팜핀 감수성 : rpoB WT1~WT5의 5개의 라인이 모두 발색한 경우 리팜핀 감수성으로 판정한다.

② 리팜핀 내성 : rpoB WT1~WT5의 5개의 라인 중 한 개라도 발색하지 않거나, MT1~MT3의 3개의 라인 중 한 개라도 발색한 경우 리팜핀 내성으로 판정한다.

③ 아이소니아지드 감수성 : katG WT, inhA WT1~WT2 및 ahpC WT1~WT5의 총 8개의 WT 라인에서 발색하면 아이소니아지드 감수성으로 판정한다.

④ 아이소니아지드 내성 : katG MT, inhA MT1~MT2의 라인 중 한 개라도 발색하거나 ahpC WT1~WT5의 5개의 라인 중 한 개라도 발색하지 않는 경우 아이소니아지드 내성으로 판정한다.

(3) 재시험 : HC라인이 발색하지 않은 경우 재시험을 실시한다.

※ REBA 결과 판독의 예

(1) HC (Hybridization Control): HC 라인은 모든 검체에서 발색하여야 한다.

(2) 음성대조액 : HC 라인만 발색 하여야 한다.

(3) 양성대조액 : HC, Myc, MTB complex, WT 전 라인(13개)이 발색하여야 한다.

(1) PCR 프리믹스

(2) 양성대조액

(3) 음성대조액

(4) DNA 추출용액

(5) 8-몹(MOP)

(1) 엠티비-엠디알 프라이머믹스

(2) 에이피 콘쥬게이트

(3) 엔비티/비씨아이피 농축액

(4) 변성시액(DS)

(1) 멤브레인

(2) 교잡시액(HS)

(3) 세척액(WS)

(4) 콘쥬게이트 희석액(CDS)

(5) 발색제 희석액(SS)

(6) 멤브레인 트레이