| 성상 | 제조방법 별첨 뒤 작성 |
|---|---|
| 업체명 | 영동제약(주)(YeongDong Phar )(수출명 : YD Diagnostics Corp.) |
| 전문/일반 | 전문의약품 |
| 허가일 | 2011-12-30 |
| 품목기준코드 | 201112328 |
| 표준코드 | 8806653017103 |
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세포보존액에 보관된 사람의 자궁 경부 조직, 세포 및 검체 채취솔에 묻어있는 검체에서 인유두종 바이러스(Human papilloma virus : HPV)의 존재유무를 확인함과 동시에 이 중 32종의 인두유종 바이러스(HPV)유전자형을 정성적으로 동정
동정 가능한 32종 인두유종 바이러스(HPV)는 아래와 같이 구분됨
High Risk Group(18종) - HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 56, HPV 58, HPV 66, HPV 59/68, HPV 69, HPV 73
Probable High Risk Group(1종) - HPV 34
Low Risk Group(13종) - HPV 6, HPV 11, HPV 32, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 54, HPV 70, HPV 72, HPV 84, HPV 81/87
1. 검체의 채취 및 보관
(1) 검체
세포보존액에 보관된 사람의 자궁 경부 조직, 세포, 및 검체채취 솔에 묻어있는 검체
(2) 검체의 준비 방법
채취된 검체는 세포보존액에 담가 실온에 준비해 둔다.
(3) 보관
세포보존액에 담가 실온에 보관한다.
2. 검사방법
(1) DNA 추출
① 1.5㎖ 튜브에 검체를 약 1㎖ 취한다.
② 8,000rpm으로 5분간 실온에서 원심분리한 후 상층액을 제거한다.
③ PBS(pH7.2)를 1㎖ 넣고, 10초간 vortex한다.
④ 8,000rpm으로 5분간 실온에서 원심분리한 후, 상층액을 완전히 제거한다.
⑤ 위③, ④ 두 과정을 1회 반복한다.
⑥ 300~500㎕의 멸균 정제수를 침전물에 넣고 10초간 vortex한다.
⑦ 13,000rpm으로 5분간 실온에서 원심분리한 후 상층액을 완전히 제거한다.
⑧ 50㎕의 DNA 추출용액을 침전물에 넣고 1분간 vortex한다.
⑨ 100℃의 Heating block에서 10분간 끓인 후, 원심분리(13,000 rpm, 3분, 실온)한다.
⑩ 상층액 3~5㎕를 주형 DNA로 사용하여 (2)번의 PCR을 수행한다.
(2) PCR
1) PCR 믹스(HPV용)
① 아래의 시약들을 제공된 2X PCR 프리믹스가 들어있는 PCR튜브에 넣어 PCR믹스(HPV용)를 만든다.
| PCR 믹스(HPV용) |
| 2X PCR 프리믹스 10 ㎕ (1 tube) 에취피브이-아이디 프라이머 믹스 2 ㎕ 검체 DNA 3~5 ㎕ 멸균된 정제수 3~5 ㎕ ------------------------------------------------------------- 총량 20 ㎕ |
② 미리 94℃로 예열된 PCR기기에 ①에서 준비한 튜브를 넣는다.
③ 아래의 프로그램으로 PCR 반응을 즉시 수행한다.
| PCR 조건 |
| Pre-denaturation 94℃ 5 min 1 cycle Denaturation 94℃ 30 sec 15 cycles Annealing 55℃ 30 sec Denaturation 94℃ 30 sec 45 cycles Annealing 52℃ 30 sec Final elongation 72℃ 10 min 1 cycle |
2) PCR 믹스(베타-글로빈용)
① 아래의 시약들을 PCR용 튜브에 넣어 PCR 믹스(베타-글로빈용)를 만든다.
| PCR믹스(베타-글로빈용) |
| PCR 프리믹스(베타-글로빈)(2X) 10 ㎕ 베타-글로빈 프라이머 믹스 2 ㎕ 검체 DNA 3 ㎕ 멸균된 정제수 5 ㎕ --------------------------------------------------------- 총량 20 ㎕ |
② 미리 94℃로 예열된 PCR기기에 ①에서 준비한 튜브를 넣는다.
③ 아래의 프로그램으로 PCR 반응을 즉시 수행한다.
| PCR 조건 |
| Pre-denaturation 94℃ 5 min 1 cycle Denaturation 94℃ 30 sec 35 cycles Annealing 55℃ 30 sec Elongation 72℃ 30 sec Final elongation 72℃ 10 min 1 cycle |
(3) Reverse Blot Hydridization Assay (REBA)
① HPV PCR 증폭 산물 15㎕, 베타-글로빈 PCR 증폭 산물 15㎕, 변성시액(DS) 30㎕(1:1:2비율)를 1.5㎖ eppendorf튜브에 넣고 섞는다.
② 튜브를 tapping 또는 약하게 vortex한 후 quick-spin하고, 25℃에서 5분간 방치하여 PCR산물을 변성시킨다.
③ 반응이 진행되는 동안, 검사에 필요한 수만큼 멤브레인을 제공된 blotting tray의 각 well에 놓고 교잡시액(HS) 1㎖를 각 well에 분주한다.
④ 변성이 끝난 ②번 혼합액을 한 검체당 한 멤브레인이 있는 bottling tray의 각 well에 분주하고, 3-4회 pipetting하여 잘 섞는다.
⑤ 멤브레인이 들어있는 blotting tray를 50℃ 항온수조에 두고, Shaking하면서 30분동안 반응시켜 혼성화 한다.
⑥ 혼성화 반응이 진행되는 동안 세척액(WS)을 50℃ 항온수조에 넣어 미리 데워 놓는다.
⑦ 각 well로부터 교잡반응액을 완전히 제거한다.
⑧ 미리 데워 놓은 세척액(WS)을 각 well에 1㎖씩 분주하고, blotting tray를 50℃ 항온수조에서 Shaking하면서 10분간 세척한다.
⑨ 세척이 끝난 tray의 각 well에서 세척액(WS)을 제거한 후 ⑧의 세척과정을 1회 더 반복한다.
⑩ 두 번째 세척이 완료되기 전에 에이피 콘쥬게이트를 콘쥬게이트희석액(CDS)으로 1:2500배로 희석하여 준비한다.(스트립 1개당 콘쥬게이트희석액(CDS) 1㎖에, 에이피콘쥬게이트 0.4㎕를 혼합하여 희석한다.)
⑪ 세척액(WS)을 제거하고 각 well에 미리 희석한 에이피 콘쥬게이트용액을 1㎖씩 분주하고 25℃에서 Shaking하면서 30분 동안 반응시킨다.
⑫ 콘쥬게이트 반응이 완료되면, 반응액을 제거한다.
⑬ 각 well에 콘쥬게이트 희석액(CDS)을 1㎖씩 분주하고 25℃에서 Shaking 하면서 1분씩 2회 반복하여 세척한다.
(4) 발색반응
① (3)-⑬번 반응이 끝나기 전에 엔티비/비씨아이피농축액을 발색제 희석액(SS)에 1:100 배로 희석한다. (스트립 1개당 발색제 희석액(SS) 1㎖에 엔티비/비씨아이피 농축액 10㎕를 혼합하여 희석한다.)
② (3)-⑬번 반응이 끝나고 각 well의 콘쥬게이트 희석액(CDS)을 완전히 제거한다.
③ 미리 희석하여 준비해 놓은 엔티비/비씨아이피/발색제 희석액(SS)을 각 well에 1㎖씩 분주한 후, 25℃에서 10분동안 발색시킨 후, 완전히 제거한다.
④ 정제수로 2회 세척한 후, 완전히 건조하여 판독한다.
3. 결과 판독
(1) 양성
① 아래의 그림 1번과 같이 HC, HPV universal probe, β-globin 라인이 발색 한 경우 32종(HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 56, HPV 58, HPV 66, HPV 59/68, HPV 69, HPV 73, HPV 34, HPV 6, HPV 11, HPV 32, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 54, HPV 70, HPV 72, HPV 84, HPV 81/87) 외의 HPV 바이러스 유전자 양성으로 판정한다.
② 아래의 그림 2~24, 26번과 같이 HC, HPV universal probe, 해당되는 균주(HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 56, HPV 58, HPV 66, HPV 59/68, HPV 69, HPV 73, HPV 34, HPV 6, HPV 11, HPV 32, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 54, HPV 70, HPV 72, HPV 84, HPV 81/87), β-globin 라인이 발색한 경우, 발색한 바이러스 유전자에 대하여 양성으로 판정한다.
(2) 음성 : 아래의 그림 25번과 같이 HC (Hybridization Control), β-globin 라인만 발색한 경우 음성으로 판정한다.
(3) 재시험
① HC라인이 발색하지 않은 경우 REBA과정에 대하여 재시험을 실시한다.
② HC라인은 발생하였으나, β-globin 라인이 발색하지 않은 경우, DNA 추출이 잘못된 것이므로 DNA추출을 다시한다.
※ REBA 결과 판독의 예
| 1. HPV 양성(32종 제외) 2. HPV 16 양성 3. HPV 18 양성 4. HPV 26 양성 5. HPV 31 양성 6. HPV 33 양성 7. HPV 35 양성 8. HPV 39 양성 9. HPV 45 양성 |
10. HPV 69 양성 11. HPV 73 양성 12. HPV 34 양성 13. HPV 6 양성 14. HPV 11 양성 15. HPV 32 양성 16. HPV 40 양성 17. HPV 42 양성 18. HPV 43 양성 |
19. HPV 44 양성 20. HPV 54 양성 21. HPV 70 양성 22. HPV 72 양성 23. HPV 84 양성 24. HPV 81/87 양성 25. HPV 음성 26. HPV 다중감염 (HPV 18, 35, 52 양성) |
4. 정도관리
(1) HC(Hybridization Control) : HC 라인은 모든 검체에서 발색하여야 한다.
(2) 양성대조액 : HC, HPV universal probe, HPV 16, β-globin 라인이 발색하여야 한다.
(3) 음성대조액(멸균 정제수) : HC라인만 발색하여야 한다.
저장방법
1. -20℃ 보관 시약
(1) 2X PCR 프리믹스
(2) PCR 프리믹스(베타-글로빈)(2X)
(3) 8-몹(MOP)
(4) 양성대조액
(5) DNA 추출용액
2. 4℃ 보관 시약
(1) 에취피브이-아이디 프라이머 믹스
(2) 베타-글로빈 프라이머 믹스
(3) 에이피 콘쥬게이트
(4) 엔비티/비씨아이피 농축액
(5) 변성시액(DS)
3. 20~25℃ 보관 시약
(1) 교잡시액(HS)
(2) 세척액(WS)
(3) 콘쥬게이트 희석액(CDS)
(4) 발색제 희석액(SS)
(5) 멤브레인
(6) 멤브레인 트레이
1. 체외진단용으로만 사용한다.
2. DNA 추출 용액은 사용 전 꼭 vortex하여 잘 혼합하여 사용해야 한다.
3. Heating block대신 가능하면 100℃의 끓는 물에서 DNA를 끓인다.
4. 모든 시료와 시약은 사용 전에 반드시 tapping 또는 약하게 vortex하여 quick-spin한 후 사용한다.
5. PCR 조건은 ABI-GeneAmp 2700, ABI-Veriti Thermal cycler, MJ-PTC200 기기로 성립된 조건이다. 다른 PCR 기기를 사용하시는 경우 조건의 변화가 있을 수 있다.
6. REBA가 성공적으로 수행되었는지 확인하시려면 제공된 양성대조액을 이용하여 확인하여야 한다.
7. 교잡시액(HS), 세척액(WS)은 보관중에 침전이 생길 수 있으므로, 사용하기 전 잘 흔들거나 항온수조에서 녹여 사용해야 한다.
8. 검체로 부터의 감염 및 검체 간의 오염을 방지하기 위하여 검사를 수행하기 전에 반드시 1회용 장갑을 착용한다.
9. 사용기한이 경과된 제품은 사용하지 말아야 한다.
10. 마개는 반드시 닫아서 보관해야 한다.
11. 본 제제는 여러 가지 요인으로 위양성, 위음성 결과의 가능성을 완전히 배제할 수 없으므로, 본 제품의 결과만을 기초로 최종진단을 해서는 안되며, 다른 검사방법과 임상소견에 근거한 전문의의 판단에 의해서 최종진단을 내려야 한다.
| 저장방법 | 용법용량 별첨 뒤 작성 |
|---|---|
| 사용기간 | 제조일로부터 12개월 (단, 발색제희석액(SS)와 엔비티/비씨아이피 농축액은 개봉 후 6개월) |
| 재심사대상 | |
| RMP대상 | |
| 포장정보 | 자사포장단위 |
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