콤비칩 에이취비브이-엠디알(CombiChip HBV-MDR) - 의약품 상세정보

(1) 항응고제가 없는 보통 시험관 (plain tube)에 B형 간염 환자의 전혈을 2 ㎖ 이상 채취 한 후 30분 이상 실온에 두었다가 3,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액인 혈청을 채취한다.

(2) HBV 게놈 디엔에이를 추출한 후 즉시 사용하거나 장기 보존시 -20℃ 이하 냉동고에 보관하여야 한다.

(1) 음성대조액

① 음성대조액을 꺼내어 완전히 녹여 가볍게 원심분리한다.

② 새로운 튜브에 10 ㎕씩 분주한 다음 -20℃ 이하 냉동고에 보관해 두고 매 검사시 하나씩 꺼내어 사용한다.

(2) 양성대조액(야생형), 인터널컨트롤액

① 양성대조액, 인터널컨트롤액을 꺼내어 완전히 녹여 가볍게 원심분리한다.

② 새로운 튜브에 10 ㎕씩 분주한 다음 -20℃ 이하 냉동고에 보관해 두고 매 검사시 하나씩 꺼내어 사용한다.

③ 매 검사시 분주해 둔 2 pg/㎕ 농도의 양성대조액과 인터널컨트롤액을 증류수를 이용하여 각각 10배씩 단계 희석하여 2 fg/㎕의 농도로 희석하여 사용한다.

(3) 교잡반응액

교잡반응액을 2~8℃ 냉장고에서 꺼내어 새로운 튜브에 95 ㎕씩 분주하여 호일로 빛을 차단한 다음 2~8℃ 냉장고에 보관해 두고 매 검사시 사용한다.

(1) B형 간염 바이러스 (HBV) 게놈 디엔에이 추출

상용되는 디엔에이 추출 키트 또는 디엔에이 추출 방법 등을 이용하여 B형 간염 환자의 혈청에서 HBV 게놈 디엔에이 (농도 10 ng/㎖ 이상, 순도 A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8 이상)를 추출한다.

(2) 1차 중합효소연쇄반응 (PCR)

① 측정하고자 하는 검체수 및 양성대조액, 음성대조액, 인터널컨트롤액에 맞게 PCR 프리믹스 I 튜브를 냉동고에서 꺼내어 가볍게 원심분리한 다음 얼음에 꽂아 둔다.

② 추출된 HBV 게놈 디엔에이, 음성대조액, 양성대조액(야생형), 인터널컨트롤액 각각 5 ㎕씩 각각의 PCR 프리믹스 I 튜브에 넣고 잘 혼합한 후 가볍게 원심분리한다.

③ 각각의 PCR 프리믹스 I 튜브를 표 1. PCR 반응 조건에 맞추어 사용하는 PCR 의료기기 작동법에 따라 반응시킨다.

(3) 2차 중합효소연쇄반응 (PCR)

① 1차 PCR 반응 검체수에 맞게 PCR 프리믹스 II 튜브를 냉동고에서 꺼내어 가볍게 원심분리한 다음 얼음에 꽂아 둔다.

② 얼음에 꽂아둔 각각의 PCR 프리믹스 II 튜브에 1차 PCR 반응 산물을 2 ㎕씩 넣고 혼합한 후 가볍게 원심분리하여 표 1. PCR 조건에 맞추어 사용하는 PCR 의료기기 작동법에 따라 반응시킨다.

※ 1차 및 2차 PCR 반응 산물의 농도가 음성대조액은 모두 10 ng/㎖ 미만이어야 하며, 양성대조액 및 인터널컨트롤액의 농도는 1차 PCR 반응 산물은 1.5 ㎍/㎖, 2차 PCR 반응 산물은 30 ㎍/㎖ 이상이어야 한다.

표 1. PCR 조건

(4) 2차 중합효소연쇄반응 (PCR) 결과 확인

① 1.5% 아가로오즈 겔 (0.5X TAE 완충액, 0.5 ㎍/㎖ EtBr 포함) 및 전기영동 장치를 준비한다.

② 준비된 1.5% 아가로오즈 겔을 전기영동 장치에 장착하고 내부를 0.5X TAE 완충액으로 채운다.

③ 1.5% 아가로오즈 겔의 첫번째 홈에 100 bp 디엔에이 사이즈 마커 5 ㎕와 6X loading dye 1 ㎕를 혼합하여 분주한다.

④ 두번째 홈부터 각각의 2차 PCR 반응 산물 5 ㎕와 6X loading dye 1 ㎕를혼합하여 분주한다.

⑤ 각 전기영동 장치의 작동법에 따라 100 볼트 (volt)에서 25분간 전기영동한 후 아가로오즈 겔을 꺼내어 사용하는 UV 장치의 작동법에 따라 표 2. 2차 PCR 산물의 크기를 확인한다.

표 2. 2차 PCR 산물의 크기

예시) 그림 1. 2차 PCR 반응산물의 전기영동 결과

※ 전기영동 결과 음성대조액은 음성, 양성대조액(야생형)은 315 bp, 인터널컨트롤액은 671 bp, 필드 (Clinical) 검체는 315 bp의 크기를 나타내야 하며 이를 벗어날 경우 HBV 게놈 디엔에이 추출 단계부터 다시 시험한다.

(5) 교잡반응

1) 교잡반응준비

① 인큐베이터를 42℃로 맞추어 놓는다.

② 교잡반응시 슬라이드 건조를 방지하기 위해 교잡반응용 용기 (예 : 팁 상자)에 증류수를 적당량 채워 준비한다 (그림 2 참조).

예시) 그림 2. 교잡반응용 용기

2) 교잡반응

③ 2차 PCR 반응 산물 각각을 95℃에서 5분간 열 변성시킨 후 얼음에 5분간 정치한다.

④ 95 ㎕씩 분주하여 보관된 교잡반응액 튜브에 열 변성된 2차 PCR 반응 산물 5 ㎕씩 각각의 튜브에 넣고 잘 혼합하여 가볍게 원심분리한다.

⑤ 올리고칩슬라이드 커버씰 각각의 웰 (구멍)에 각 교잡반응 혼합용액 100 ㎕씩 주입하고 조심스럽게 교잡반응용 용기에 올린 다음 42℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다.

(6) 칩 세척(교잡반응 후) 및 건조

① 20X SSC 용액을 증류수로 희석하여 2X SSC, 0.2X SSC 세척 용액을 제조한 다음 각각의 세척액을 300 ㎖ 이상 염색자 (Stain Jar)에 넣어 준비한다 (20X SSC 용액은 별도 구매 필요).

예시) 표 3. 세척 용액 제조

② 교잡반응이 끝난 올리고칩슬라이드 위에 부착된 커버씰을 조심스럽게 제거한 다음 슬라이드 랙 (slide rack) (그림 3 참조)에 꽂아 준비된 300 ㎖의 2X SSC 용액이 담겨진 염색 자 (Stain Jar)에 넣고 실온에서 600 rpm 교반기에서 5분간 세척한다 (그림 4 참조).

③ 다시 300 ㎖의 0.2X SSC 용액이 담겨진 염색 자 (Stain Jar)에 옮겨 600 rpm 교반기에서 5분간 세척한다 (그림 4 참조).

④ 세척이 끝난 올리고칩슬라이드는 남아있는 용액을 제거하기 위하여 평면 원심분리기로 1,000 rpm에서 1 분간 원심분리한다.

(7) 스캐닝 및 결과분석

1) 스캐닝 준비

① 스캐너 (ScanArray^® Gx, PerkinElmer사)의 전원을 켠다.

② 스캐너 전면의 두 개 램프 (Power/Ready)가 녹색으로 점등된 후 컴퓨터의 전원을 켠다.

③ 윈도우 화면상의 ScanArray Express 프로그램을 실행시킨다.

④ 초기화면 우측 메뉴의 "Instrument Status"가 초록색의 “Connected"인지 확인(그림 ④)한 후 초기화면 우측 메뉴의 Laser 1 (파장 633 nm) (그림 ⑤)을 클릭한다.

2) 스캐닝 하기

① 15분후 "Laser 1" 버튼이 녹색으로 바뀌면 반응된 올리고칩슬라이드 분석면을 위쪽으로 향하도록 하고 스티커 부착 반대쪽을 스캐너 투입구에 삽입한다.

※ 투입구 끝까지 수평으로 밀어 넣는다.

② 초기화면 좌측 상단에 “Scan"을 클릭한 후 다음 사항을 확인한다.

a. Scan type : Run Easy Scan

b. Scan resolution (㎛) : 10

c. Fluorophore : Cyanine 5 (PMT 70% & Laser Power 90%)

d. Scan Area Co-ordinates

③ "Start" 버튼을 누른 후 스캔이 완료되면 “Unadjusted" 버튼을 눌러 자동으로 이미지의 최적 명암을 맞춘다.

3) 스캔 이미지 저장하기

① 좌측 메뉴의 “File" 버튼을 누른다.

② 새 창이 뜨면 “Save As" 버튼을 누른다.

③ 파일 이름을 입력하고 파일 형식은 "TIF"로 저장한다.

4) 스캔 이미지 정량화하기

① 좌측 메뉴의 “Quantitate" 버튼을 누른다.

② "Quantitation type"에서 “Run a quantitation protocol”을 선택한다.

③ "Quantitation protocol"에서 “CombiChip HBV-MDR"을 선택한다.

④ “Adjust Template and Register Images" 버튼을 눌러서 template를 스캔 이미지에 맞춘다.

⑤ “Start" 버튼을 누른다.

5) 정량 데이터 (GPR 형식) 저장하기

① 좌측 메뉴의 “File" 버튼을 누른다.

② 새 창이 뜨면 “Save As" 버튼을 누른다.

③ 파일 이름을 입력하고 파일 형식은 "GPR"로 저장한다.

6) 결과 입력

① 5)에서 저장한 GPR 형식의 정량 데이터를 엑셀 프로그램을 이용하여 연 다음 I열과 L열 전체를 복사한다.

② 엑셀 문서로 제공된 "CombiChip HBV-MDR 분석 프로그램 (자동분석을 수행 할 수 있는 프로그램 양식)"을 연 다음 ①에서 복사한 I열과 L열을 C열과 D열에 붙여 넣으면 “CombiChip HBV-MDR 시험검사성적서”에 결과 판정에 필요한 값들이 자동적으로 계산되어 진다.

③ 자동으로 계산 되어진 “CombiChip HBV-MDR 시험검사성적서”의 각 프로브별 3개의 스팟 (spot 1, spot 2, spot 3) 각각의 SBR, SBR 평균, M/W값으로 결과를 판독한다.

(1) 음성대조액

음성대조액으로 시험하였을 때 63개 (21종 프로브 X 3 스팟) 스팟 (spot) 각각의 SBR이 모두 4 미만이어야 한다.

(2) 인터널컨트롤액

인터널컨트롤액으로 시험하였을 때 인터널컨트롤 프로브의 3개 스팟 각각의 SBR이 모두 4 이상이어야 한다.

(3) 양성대조액

양성대조액으로 시험하였을 때 N236-1를 제외한 모든 야생형 (Wild type) 프로브 (V173, L180, A181, M204, V207, N236-2, N238)의 3개 스팟 각각의 SBR이 모두 4 이상이고, 표 4의 HBV rt 유전자 아미노산 코돈 위치별 M/W값 (cut-off)를 만족하여야 한다.

표 4. 양성대조액(야생형) 판정 기준

1) HBV rt

: B형 간염 바이러스 (HBV) 역전사 효소 (Reverse Transcriptase, rt)

2) M/W값 계산식

= 돌연변이형 (Mutant type) 프로브의 SBR 평균값/ 야생형 (Wild type) 프로브의 SBR 평균값

(4) 임상 검체

① 돌연변이형 (Mutant type)

돌연변이형 프로브의 3개 스팟 각각의 SBR이 4 이상이고, 각 형의 M/W값이 표 5. 임상 검체 판정 기준 중 M/W값 (cut-off) 초과인 경우

② 야생형 (Wild type)

야생형 프로브의 3개 스팟 각각의 SBR이 4 이상이고, 각 형의 M/W값이 표 5. 임상 검체 판정 기준 중 M/W값 (cut-off) 이하인 경우

표 5. 임상 검체 판정 기준

1) HBV rt

: B형 간염 바이러스 (HBV) 역전사 효소 (Reverse Transcriptase, rt)

2) M/W값 계산식

= 돌연변이형 (Mutant type) 프로브의 SBR 평균값/ 야생형 (Wild type) 프로브의 SBR 평균값

(5) 재시험

① 음성대조액으로 시험하였을 때 1개 이상 프로브의 3개 스팟 각각의 SBR이 모두 4 이상인 경우 1차 PCR 반응부터 재시험한다.

② 인터널컨트롤로 시험하였을 때 인터널컨트롤 프로브의 1개 이상 스팟의 SBR이 4 미만인 경우 교잡반응부터 재시험한다.

③ 양성대조액으로 시험하였을 때 N236-1를 제외한 모든 야생형 프로브의 3개 스팟 각각의 SBR이 모두 4 이상이 아니거나, 표 4의 HBV rt 유전자 아미노산 코돈 위치별 M/W값 (cut-off)를 만족하지 않을 경우 교잡반응부터 재시험한다.

④ 임상 검체로 시험하였을 때 야생형 프로브의 3개 스팟 가운데 1개 이상 스팟의 SBR이 4 미만이고, 돌연변이형 프로브의 3개 스팟 가운데 1개 이상 스팟의 SBR이 4 미만인 경우 교잡반응부터 재시험한다.

⑤ 임상 검체로 시험하였을 때 모든 야생형 프로브의 3개 스팟 가운데 1개 이상 스팟의 SBR이 4 미만이고, 모든 돌연변이형 프로브의 3개 스팟 가운데 1개 이상 스팟의 SBR이 4 미만인 경우 B형 간염 바이러스 (HBV) 게놈 디엔에이 추출부터 재시험한다.

(1) 내성 발생 초기에 변이종 (mutant type)이 미량 혹은 전체 바이러스의 30% 이하를 차지하는 경우 돌연변이가 검출이 안 될 수 있다.

(2) 인접 부위의 돌연변이에 의해 위양성/위음성 또는 판독이 불가할 수 있다.

① rt180 (180M 또는 180V), rt181 (181V 또는 181T)에 동시에 돌연변이가 있을 경우 위양성/위음성이 발생할 수 있으므로 다른 돌연변이 검사법으로 시험하여 판정한다.

② rt204 (204V 또는 204I), rt207 (207I)에 동시에 돌연변이가 있을 경우 위양성/위음성이 발생할 수 있으므로 다른 돌연변이 검사법으로 시험하여 판정한다.

③ rt236 (236T1 또는 236T2), rt238 (238S 또는 238H)에 동시에 돌연변이가 있을 경우 위양성/위음성이 발생할 수 있으므로 다른 돌연변이 검사법으로 시험하여 판정한다.

(3) M/W값이 M/W값 (cut-off)의 ± 5% 내인 경우 재시험을 권장한다.

(4) 재시험에서도 동일하게 판독이 불가능 할 경우, “CombiChip HBV-MDR”에 포함되지 않은 돌연변이형 (Mutant type)일 가능성이 있으므로 다른 돌연변이 검사법으로 시험하여 판정한다.

(5) 헤파린 (heparin) 또는 시트르산 나트륨 (sodium citrate)은 PCR 저해제로 결과 판독에 영향을 줄 수 있으므로 채혈시 항응고제가 들어가 있지 않는 보통 시험관 (plain tube)을 사용한다.

(1) CombiChip HBV-MDR은 B형 간염 치료제 (라미부딘, 아데포비어)에 의한 약제 내성 변이가 일어나는 HBV 역전사 효소 (reverse transcriptase, rt)내의 7개의 아미노산 코돈 (codon)의 변이 유무를 판정하는 것으로 판정 가능한 변이 종류는 11종이다.

표 6. 11종 HBV 약제 내성 돌연변이 (Mutant)

* HBV rt

: B형 간염 바이러스 (HBV) 역전사 효소 (Reverse Transcriptase, rt)

(2) CombiChip HBV-MDR의 올리고칩슬라이드는 그림 5와 같이 7개의 각 아미노산 코돈별로 야생형 (wild type)과 돌연변이형 (mutant type) 프로브가 존재하고 동일형의 각 프로브에 대해서 3개의 스팟이 집적 (spotting)되어 있다.

그림 5. CombiChip HBV-MDR 올리고칩슬라이드 구성

(3) 판정에 필요한 각 SBR, SBR 평균, M/W값은 각 검사별 올리고칩슬라이드의 정량 데이터 (GPR 형식)를 제공된 “CombiChip HBV-MDR 분석 프로그램”에 적용하면 자동적으로 계산되어지며 계산된 각 SBR, SBR 평균, M/W값의 계산식은 아래와 같다.

① SBR (Signal-to-Background Gray level Ratio)

= 스팟 신호값 (F633 median)/background 신호값 (B633 median)

② SBR 평균

= (동일한 프로브로 집적되어 있는 3개 스팟 SBR 합계) ÷ 3

= (spot 1 + spot 2 + spot 3 SBR) ÷ 3

③ M/W값 = 돌연변이형 (Mutant type) 프로브의 SBR 평균/야생형 (Wild type) 프로브의 SBR 평균

그림 6. CombiChip HBV-MDR 판정 방식

예시) 결과 판정

8. 결과 오류 해결 방법